请教：elisa实验TMB底物孵育时间和温度的问题...

1.听人说TMB底物常温避光反应也可以，我能不能常温呢？这样我就好控制反应时间，还是继续37度孵育，把孵育时间缩短到10分钟甚至5分钟

一般来讲标曲应当是厂家优化过后的，不应该存在这么大的问题，会不会是你在孵育完酶标抗体之后洗涤不充分，孔内残留的非特异性结合的酶标抗体太多，导致所有孔OD值偏高。常温避光也是可以的，37度只是因为这是酶的最适工作温度，换成室温的话，盒子的灵敏度肯定会下降

2.高浓度血清标本（不稀释、1/10稀释）测出负值应该怎么解释，厂家技术支持说可能浓度太大影响抗原抗体结合，这个能说得通吗？

这个是说的通的，术语叫做勾状效应（Hook effect），你百度一下就明白了，高浓度的抗原导致的假阴性，所以样本一定要稀释到合适的浓度。

3.空白孔是不是应该不变色才对？空白孔显色是不是洗板时孔间污染导致的？要是这样的话，为什么前六点（含空白）标曲是好的？

理论上是不显色的，但实际操作中，除了抗体与抗原间的结合外，难免有一些非特异性的吸附，这都会导致空白孔显色，空间污染一般会导致某一孔的OD值明显出现大的偏差，不会落在标曲上的