请问：有人用过takara的5‘race试剂盒吗？...

请问：有人用过takara的5‘race试剂盒吗？

我也准备做，不过我师姐做了一次5‘race，可是没做出来，也不知是提的RNA的问题，还是试剂盒的问题，最近准备再重做一次。
但是takara的3’RACE用过，效果不错。

5’的我用过，效果不错啊！但有以下几点要注意啊
1、对所用的RNA的要求较高，尽量为新提取
2、每次所得到的片段数目有限，说明书上为1000BP以下，但我所得到的一段为500，一段为300，所以长片段的可能要多次操作。
3、每次都需合成带有磷酸化位点的反转录引物及四段特异性引物，所需代价较高，且操作尚有些复杂。
但效果还不错啦　。

谢谢楼上的二位，再请教takara的5‘race里引物怎么设计？

1　、反转录引物设计时没有什么要点，5’端加一个磷酸化位点，长度12－15个，设计时尽量靠近5’末端的已知序列。
2　、nested PCR引物设计时同普通PCR引物设计，20mer 左右，GC含量在50%左右，保证GC　AT颁均匀，避免富有GC或AT，特别是3’端不要富含AT　引物设计用软件即可
3　、在做1stPCR时，我一般选择较低的退火温度，电泳结果出现smear,在2ndPCR时，就会出现一条明亮的条带。