细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8),增强型

CCK-8试剂中含有WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）是一种类似于MTT的化合物，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan （参考图1），生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

 

图1. WST-8检测原理图 (EC=electron coupling reagent，即电子耦合试剂)

WST-8与以往的增殖/毒性测定试剂相比，具有明显优点（参考表1），广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。

表1. 增殖/毒性测定试剂的比较

• 灵敏度高，线性范围宽，数据可靠，重现性好
• 操作简便，省时省力
• 水溶性，不需要换液，尤其适合于悬浮细胞
• 无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低
• 为1瓶溶液，毋需预制，即开即用
• 适合于高通量药物筛选
• 检测效果与国外品牌相媲美

对照实验：采用某国外品牌CCK-8试剂盒作为对照，在相同的实验条件下，检测细胞的活力。 
"检测结果：如图2所示，雅吉生物细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)测得的吸光值/细胞数目比值更大，灵敏度更高，与某国外品牌CCK-8试剂盒相比实验差异极小（在5%左右，几乎相当于不同批次之间的差异）。

图2. 使用雅吉生物CCK-8与其他国外品牌CCK-8灵敏度的比较

4℃避光保存，一年有效。-20℃可以储藏更久，但反复冻融会增加背景值，干扰实验测定，因此请将经常使用的试剂保存在4 ℃。 

实体组织单细胞 悬液的制备
 
      1.机械法
       ①用剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织；
       ②将剪碎的组织加入匀浆器中匀浆；
       ③用吸管或注射器抽吸细胞悬液，以分散细胞；
       ④将细胞悬液在尼龙网或不锈钢网上过滤，滤出的细胞悬液细胞计数后即可使用。

      2. 酶处理法 
       此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用，所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能结合组织中的二价钙离子和镁离子，而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用，因此，几种酶和EDTA联合使用有助于充分消化实体组织，提高细胞产出效率。下面仅介绍组织消化的一般过程，对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。
       ①将组织剪成1～2mm3左右的小块。
       ②用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0.1％～0.5％。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25％胶原酶，胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0.1～0.3ug／ml。用大于组织量30～50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织，需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶需作用20～60分钟，胶原酶需4～48小时。在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。
      ③消化完毕后，将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的组织。
      ④已过滤的细胞悬液经800～1000rpm低速离心5～10分钟后，弃上清液，加PBS液，轻轻吹打形成细胞悬液，细胞计数后即可使用。
 

• 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
• CCK-8反应时间的确定：一般情况下，白细胞显色比较困难，因此需要增加细胞数量和延长CCK-8反应时间。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色，因此悬浮细胞在加入CCK-8培养1-4小时后，可先从培养箱取出，目测或用酶标仪测定显色程度，若显色困难可以继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞，CCK-8的培养时间一般为1-4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度。
• 每孔接种细胞数：当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔 (100 μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔 (100 μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
• 设定空白对照：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验（细胞毒性实验）时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
• 影响CCK-8测定的物质：由于CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应，所以如果待测体系中存在氧化还原物质则可能会干扰检测结果，还原性物质会使吸光度增加，氧化性物质会使吸光度减小，因此应需设法去除这些物质的影响。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除只含有培养基的对照孔中本底吸光度而消除，因此不会对检测结果造成影响。
• 测定波长：如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450nm，参比波长600-650nm。如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片，但是450nm检测灵敏度最高。
• 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
• 如果细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化，应洗涤细胞更换培养基后再加CCK-8检测。
• 为了您的安全和健康，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。