二胺氧化酶测定试剂盒 微量法

测定意义: 
DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛，其活性与核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。 
测定原理:
DAO 催化尸胺产生醛和过氧化氢，外源添加过量的辣根过氧化物酶，催化过氧化氢氧化邻 联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺，在 460nm 处有特征吸收峰，通过测定该波长吸光度增加 速率，计算 DAO 活性。 
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制 
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 
试剂一：液体 0.25mL×1 支，4℃保存。 
试剂二：液体 2mL×1 管，4℃保存。 
试剂三：液体 1mL×1 管，4℃保存。  
粗酶液提取 
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。 
3. 血清等液体：直接测定。
 
测定操作表
1、分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 460nm，蒸馏水调零。 
2、操作表
 
对照管
测定管
粗酶液（μL）
50
50
提取液（μL）
128
108
试剂一（μL）
2
2
试剂二（μL）
20
20
试剂三（μL）
 
20
混匀，37℃水浴 30min，微量石英比色皿/96 孔板，蒸馏水调零，测定 460nm 吸光值。ΔA=A 测定-A 对照。
 
酶活性计算公式： 
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 
（1）按样本蛋白浓度计算： 
酶活性定义：在 pH7.2，温度为 37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 
DAO 活性（nmol/min/mg prot）= d A e ′ 460 ×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 18×A460÷Cpr （2）按样本质量计算： 
酶活性定义：在 pH7.2，温度为 37℃条件下，每克组织每分钟催化产生 1nmol H2O2所需 的酶量定义为一个酶活力单位。 
DAO 活性（nmol/min/g）= d A e ′ 460 ×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）÷T= 18×A460÷W （3）按细胞数量计算： 
酶活性定义：在 pH7.2，温度为 37℃条件下，每 104 个细胞每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量定义为一个酶活力单位。 
DAO 活性（nmol/min/104 cell）= d A e ′ 460 ×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量）÷T= 18×A460÷ 细胞数量 
(4) 按液体体积计算 
酶活性定义：在 pH7.2，温度为 37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生 1nmol H2O2 所 需的酶量定义为一个酶活力单位。 
DAO 活性（nmol/min/mL）= d A e ′ 460 ×V 反总÷V 样÷T= 18×A460 ε：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；
V 反总：反 应总体积，0.2mL；V 样：反应中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr： 样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min 
 
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下 
（1）按样本蛋白浓度计算： 
酶活性定义：在 pH7.2，温度为 37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 
DAO 活性（nmol/min/mg prot）= d A e ′ 460 ×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 36×A460÷Cpr （2）按样本质量计算： 
酶活性定义：在 pH7.2，温度为 37℃条件下，每克组织每分钟催化产生 1nmol H2O2所需 的酶量定义为一个酶活力单位。 
DAO 活性（nmol/min/g）= d A e ′ 460 ×V 反总÷（V 样÷V 样总×W）÷T= 36×A460÷W （3）按细胞数量计算： 
酶活性定义：在 pH7.2，温度为 37℃条件下，每 104 个细胞每分钟催化产生 1nmol H2O2 所需的酶量定义为一个酶活力单位。 
DAO 活性（nmol/min/104 cell）= d A e ′ 460 ×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量）÷T= 36×A460÷ 细胞数量 
(4) 按液体体积计算 
酶活性定义：在 pH7.2，温度为 37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生 1nmol H2O2 所 需的酶量定义为一个酶活力单位。 
DAO 活性（nmol/min/mL）= d A e ′ 460 ×V 反总÷V 样÷T= 36×A460 ε ：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L /mmol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；
V 反总： 反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min 
 
注意事项： 
1、如果 OD 值小于 0.01，适当加大提取用样本量；OD 值大于 0.8，粗酶液可适当稀释，或 者减少提取用样本量。 
2、样品蛋白质含量需要另外测定。