各位大神，我想请教一个问题，我目前通过crispr/cas9系统敲除了小鼠某个基因，通过PCR获得了该基因的片段，通过测序发现敲除的片段只有2-15bp,因此不能通过凝胶电泳分离目的基因鉴定小鼠属于野生，单敲还是双敲，但通过测序我们可以鉴定出野生型以及单敲、双敲，而不能区分双敲和单敲，因为它们的测序结果在敲除片段的峰都是杂峰。因而，我们将PCR产物通过TA克隆然后转入大肠杆菌中培养，然后随机的挑选8个单克隆菌落，每个菌落培养后，再测序，并且与该基因序列对比，8个菌落均来自同一个founder小鼠，为什么测序结果8个菌落敲除得片断大小都不一样？我怎么通过TA克隆结果判断是否敲除成功了？
Cas9 founder 小鼠基因型鉴定
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- 楼主formumaxscienti
- 2017-05-11 15:09
- 沙发sicaujj
- 2017-05-11 19:43
alex541248115各位大神，我想请教一个问题，我目前通过crispr/cas9系统敲除了小鼠某个基因，通过PCR获得了该基因的片段，通过测序发现敲除的片段只有2-15bp,因此不能通过凝胶电泳分离目的基因鉴定小鼠属于野生，单敲还是双敲，但通过测序我们可以鉴定出野生型以及单敲、双敲，而不能区分双敲和单敲，因为它们的测序结果在敲除片段的峰都是杂峰。因而，我们将PCR产物通过TA克隆然后转入大肠杆菌中培养，然后随机的挑选8个单克隆菌落，每个菌落培养后，再测序，并且与该基因序列对比，8个菌落均来自同一个founder小鼠，为什么测序结果8个菌落敲除得片断大小都不一样？我怎么通过TA克隆结果判断是否敲除成功了？
因为你的细胞来源是一个mix，每个细胞里面dna修复的都不一样。这种方法确实没办法确定是单敲或者双敲。你可以设计一个donor，先ki 这个很好鉴定。然后再加cre切。
- 藤椅schorr
- 2017-05-14 06:47
alex541248115各位大神，我想请教一个问题，我目前通过crispr/cas9系统敲除了小鼠某个基因，通过PCR获得了该基因的片段，通过测序发现敲除的片段只有2-15bp,因此不能通过凝胶电泳分离目的基因鉴定小鼠属于野生，单敲还是双敲，但通过测序我们可以鉴定出野生型以及单敲、双敲，而不能区分双敲和单敲，因为它们的测序结果在敲除片段的峰都是杂峰。因而，我们将PCR产物通过TA克隆然后转入大肠杆菌中培养，然后随机的挑选8个单克隆菌落，每个菌落培养后，再测序，并且与该基因序列对比，8个菌落均来自同一个founder小鼠，为什么测序结果8个菌落敲除得片断大小都不一样？我怎么通过TA克隆结果判断是否敲除成功了？
动物上最常用的是测交，就是用野生型的小鼠和G0代的小鼠交配产生后代再检测后代的基因型，就能说明问题了。后代中只要有50%左右的阳性，G0就是杂合子，差不多100%的杂合子，那么G0就是纯合子。
- 板凳alex541248115
- 2018-01-07 14:02
谢谢回答，非常感谢
- 马扎wenf98
- 2018-03-16 15:43
对，F0测交筛选鉴定