分子生物学：总 RNA 提取实验服务

实验技术简介：完整RNA的提取和纯化，是进行RNA 方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）样品细胞或组织的有效破碎；２）有效地 使核蛋白复合体变性；３）对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质 的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。

实验技术原理：
GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白 复合体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和 DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而 RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

实验操作流程： 
一、细胞或组织破碎
1、微生物材料
（1）发酵3~4天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。
（2）用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次，并尽量除去残存的水。
（3）加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。
（4）研磨后的样品转移至12 ml 变性液的容器中匀浆。
2、动植物细胞培养材料 （适用的样品量为细胞：108）
（1）细胞或组织培养：按常规方法进行。
（2）深层悬浮培养细胞的破碎。
①细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3 000 g 离心5分钟。
②细胞洗涤：上步沉淀用25 ml 灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3 000 g 离心5分钟。
③细胞破碎：在沉淀细胞中加入15 ml 预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。
3、表面培养细胞的破碎
（1）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。
（2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8 ml 预冷变性液。
（3）转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。
（4）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推。
（5）直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。
（6）将上述12 ml 含细胞的变性液转移至一50 ml 无菌离心管中，匀浆破碎细胞。
4、植物组织破碎 （适用的样品量为0.05 g 组织）
（1）将600 ul 变性液置于1.5 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。
（2）将0.05 g 新鲜组织用液氮冰冻。
（3）在液氮下，研磨组织块。
（4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。
5、动物组织破碎 （适用的样品量为1 g 组织）
（1）将12 ml 变性液置于50 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。
（2）在上述管中加入1 g 新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。
 
二、RNA 的抽提
1、在经变性液匀浆的细胞或组织600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。
2、600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
3、冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。
4、上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇，-80℃，30分钟沉淀RNA。
5、离心4℃，10 000 g，20分钟。
6、沉淀RNA ，冷冻干燥15分钟 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。
7、60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。
8、600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
9、冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。
10、上层水相吸至无菌离心管中。
11、等体积异丙醇二次沉淀（-80℃，30分钟），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥。
12、复溶于去RNA 酶的水中（对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 M，再加入2.5体积的乙醇，-80℃保存。）。

实验注意事项：
客户提供：
1、组织样品：新鲜组织放入液氮或-80度保存，组织不少于100mg；
2、培养细胞：通过细胞计数取不少于2×10⁶个细胞于EP管，加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱（-80℃，避免反复冻融）；
3、血液细胞标本：以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，保存（-80℃可长期保存，避免反复冻融）；
4、血清或细胞培养液标本：离心去掉杂质后取上清入EP管，保存（4℃可保存15-20天，-80℃可长期保存，避免反复冻融）；
5、样本运输：可选择以下任何一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后，加冰袋寄送；
细胞样本也可直接寄送培养瓶（密封保证不污染、培养液不漏出）；
血清或上清液直接加冰袋寄送（送视路程远近2-3天可到达）。
交付标准：
提取的总 RNA