分子生物学：慢病毒载体的 miRNA 载体构建实验服务

实验技术简介：miRNA是一种21－25nt长的单链小分子RNA, 是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性.而且这种特异 性和时序性，决定了组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用，因此miRNA的研究受到了生物学家的广泛关 注。

实验操作流程：
1、慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2、慢病毒干扰质粒载体的构建
合成miRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3、慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。