芯片类检测：piRNA 芯片定制检测服务

实验技术简介：piRNA（Piwi- interacting RNA）是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类非编码小RNA，这类小RNA可与Piwi（P-element Induced Wimpy Testis）蛋白家族成员相互作用。Piwi蛋白家族包括在果蝇上表达的Piwi、 Aubergine 和AGO3蛋白，在小鼠上表达的MILI、MIWI 和 MIWI2蛋白，以及在人上表达的HILI、 HIWI1、 HIWI2和HIWI3蛋白[1]。虽然piRNA的生物起源和功能还未完全阐明，越来越多的证据表明piRNA对生殖细胞的发育非常关键。

成熟的piRNA是一类长约26-32nt的单链小RNA分子。在小鼠睾丸内只存在几百种不同的miRNA，而piRNA却至少有5万种[2]。piRNA即使在近缘物种之间保守性也很差，在长度、表达类型和基因结构上则与microRNA截然不同。

实验技术原理：Arraystar的科学家已经研制了针对人、小鼠和大鼠的 piRNA芯片，可以对piRNA的总体表达情况进行检测。三个物种的piRNA序列都来自NCBI数据库，并且使用UCSC Blat技术在HG19, MM9 和 RN4数据库中分别进行染色体定位（map）。采用恰当的策略来挑选探针，然后使用双重方法（duplex method）设计60 mer的反义寡核苷酸探针。

实验操作流程：
1、样品RNA抽提
2、RNA 质量检测
    a. 使用Nanodrop测定RNA 在分光光度计260nm 、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
    b. 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA 纯度及完整性。
    c. 提供RNA QC报告。
    注意：用于芯片检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有RNase污染（降解的样品不能用于标记和芯片检测），没有基因组污染。
3、制备荧光标记探针：使用Arraystar标记试剂盒荧光标记piRNA
4、芯片杂交：在标准条件下使用杂交仪将标记好的探针和Arraystar piRNA芯片杂交。
5、图像采集和数据分析：使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。
6、提供实验报告—— 包括详细的实验方法和芯片实验数据及图表
   a. 芯片扫描图
   b. 操作说明（含RNA质检报告）
   c. 芯片数据
   数据汇总表格（EXCEL格式，包含探针位置，探针名称，原始信号值，修正信号值，标准化信号 值，样品间piRNA表达量的比值）
   差异表达piRNA的数据表格（EXCEL格式，包含表达上调2倍的piRNA和表达下调2倍的piRNA）
   d. 进一步数据分析
   Scatter Plot（主要针对单色重复实验数据进行相关性R值计算）
   分层聚类（进行多个样品实验时，按基因表达相似程度进行聚类，从而将多个样品进行归类）
若进行重复实验（≥3）则计算CV值、p值，并做Volcano Plot

实验注意事项：
客户提供：
1、实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1ml的 RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。
2、实验对象为细胞样品，每份样品取1×10⁶～1×10⁷细胞，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml），裂解后抽提RNA。
交付标准：
1、芯片检测数据
2、完整的实验操作规程、实验报告（含软件分析结果）以及实验材料

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