Santa Cruz公司产品Protocols及相关支持产品（二）

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供应商：	Santa Cruz

5．免疫过氧化物酶细胞染色

A． 组织培养细胞

l 在无菌的盖玻片上培养细胞37℃过夜。PBS简单冲洗后按以下程序之一固定细胞：
1）-10℃甲醇溶液5min，自然干燥（推荐方法）；或
2）冰丙酮2min，自然干燥；或
3）1%甲醛-PBS 10min（保持湿润）。
l PBS洗三次。
可选择：含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min，淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

B．冰冻组织切片

l 冰冻组织存放于液氮中。切片前（2周）可保存于-70℃。
l 95%乙醇清洁玻片，涂一薄层黏附剂，自然晾干。或使用预处理的玻片。
l 切片厚度4-10μm。室温贴片。切片保存在-70℃。固定染色前室温解冻切片。

注意：免疫组化切片固定剂清单包括Clarion和Crystal固定剂。

l 冰丙酮固定切片10min，冷藏。PBS洗三次。
可选择：含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min，淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。
注意：组织内有丰富的生物素（引起高背景染色），建议甲醛固定，遵循石蜡包埋组织切片protocol，因为石蜡包埋组织中内源性生物素被破坏。

C． 甲醛固定，石蜡包埋组织切片

l 按标准程序甲醛固定，石蜡包埋组织。
l 95%乙醇清洁玻片，涂一薄层黏附剂，自然晾干。或使用预处理的玻片。
l 切片厚度4-6μm。二甲苯脱蜡，3次，5min/次。依次过梯度酒精水化：100%乙醇，2次，10min/次，95%乙醇，2次，10min/次。去离子水浸洗1min。甩去切片上多余的液体。

可选择：可做抗原修复。甲醛固定和石蜡包埋导致某些抗原决定簇被封闭，可按以下方法修复暴露抗原位点：

i. 热修复(推荐方法)：切片浸没入10mM柠檬酸钠缓冲液（sc-29109），pH6.0；或浸没入含0.01% （w/v）EDTA（sc-29092）的50mM甘氨酸-HCl缓冲液（甘氨酸：sc-29096）中，pH3.5。95℃加热5min。换新的缓冲液，95℃加热5min。（不同组织类型最佳孵育时间不同）。将切片放入缓冲液中冷却约20min。用去离子水洗3次，2min/次。甩干切片。
ii. 胃蛋白酶：切片用含0.1%胃蛋白酶的0.01N HCl室温孵育10-20min。去离子水冲洗几次，甩去多余液体。
iii. 皂角苷：切片用含0.05%皂角苷的去离子水室温孵育30min。PBS至少洗3次，甩去多余液体。

可选择：切片在含0.1-1%过氧化氢的去离子水中孵育5-10min，淬灭内源过氧化物酶活性，PBS洗2次，5min/次。

注意：组织内有丰富的生物素（引起高背景染色），建议甲醛固定，遵循石蜡包埋组织切片protocol，因为石蜡包埋组织中内源性生物素被破坏。

D．免疫过氧化物酶染色

l 切片的免疫酶染色，建议用Santa Cruz的ABC染色试剂盒或ImmunoCruzTM染色试剂盒。ABC染色试剂盒利用亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物作为检测物；而ImmunoCruzTM染色试剂盒利用链亲和素辣根过氧化物酶复合物作为检测物，该体系包括所有预稀释好的第二抗体，即用型，也包括预稀释的第一抗体。所有染色体系中均有完整的protocol；以下为简化版protocol。
l 所有反应步骤均于室温下湿盒内完成。使用前试剂盒试剂要先恢复至室温。操作中切片不能过干。每步操作完用吸引管吸除试剂，避免切片过干。要用足够的反应液覆盖标本（通常100μl/张切片就足够了）。

ABC染色试剂盒

l PBS稀释的1.5%封闭血清孵育1hr。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。
l 滴加第一抗体室温孵育30min或4℃过夜孵育。抗体最佳反应浓度需经滴定确定；建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次，5min/次。
l 滴加预稀释的生物素化第二抗体或用含1.5%封闭血清的PBS稀释至1μg/ml的生物素化第二抗体，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。
l 滴加亲和素生物素酶反应物，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。
l 用提供的过氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出现理想染色止。注意监控单张切片的恰当显色时间。去离子水洗5min。可用苏木素（sc-24973）复染5-10s。迅速用去离子水洗几次。
l 梯度酒精，二甲苯依次脱水：浸没入95%乙醇2次，10s/次，然后100%乙醇2次，10s/次，最后二甲苯3次，10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加1-2滴封片固定剂（如Clarion，sc-24942），盖上盖玻片（sc-24975），光学显微镜下观察。

ImmunoCruzTM染色试剂盒

l 滴加1-3滴血清封闭液孵育20min。甩去封闭液。
l 迅速加入1-3滴预稀释的第一抗体。如果所用染色系统不含预稀释的抗体，就把第一抗体用血清封闭液稀释至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS冲洗，然后切片浸没入PBS内洗2次，2min/次。甩去多余的液体。
l 滴加1-3滴生物素化第二抗体，孵育30min。清洗同上步。
l 滴加1-3滴HRP-链亲和素复合物，孵育30min。清洗同上步。
l 滴加1-3滴HRP底物混合物。显色30s-10min，或直至出现理想染色止。去离子水冲洗，然后切片浸没入去离子水内洗2次，2min/次。
l 复染，脱水，封片。（同ABC染色试剂盒）

6．免疫荧光细胞染色

l 切片准备同免疫酶染色，省去包括过氧化氢处理细胞在内的最后一步。
l 每步操作完吸除反应液，但要避免样品过干。用足够的反应液覆盖样品（100-500μl/张切片）。
l 滴加含10%封闭血清-PBS，孵育20min，减少和IgG结合的非特异位点。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。
l 滴加第一抗体，孵育60min。抗体最佳反应浓度应滴定决定；建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml，PBS洗3次，5min/次。
l 滴加生物素标记或荧光染料标记的第二抗体（用含1.5%-3%封闭血清的PBS稀释至1-5μg/ml），孵育45min。PBS洗3次。如果使用荧光染料标记的第二抗体，须暗室孵育，并省略下步。
l 滴加链亲和素-荧光素，暗室孵育15min。链亲和素标记物浓度需经滴定决定；建议PBS稀释至10-20μg/ml。PBS充分洗净。
l 用水相固定剂或90%甘油PBS溶液封片。
l 选择适当的滤镜在荧光显微镜下观察。室温避光保存切片（UltraCruzTM固片剂：sc-24941）或保存在4℃（甘油/PBS固片剂）。

7．流式细胞仪技术

细胞表面染色

l 准备细胞
1) 溶解血红细胞。（注意：准备足够的细胞用于10份样品100μl/份检测）。
l 1ml全血加入14ml恢复至室温的1×FCM溶解液（sc-3621）中。
l 轻轻混匀，室温孵育3-5min。不要超过5min。
l 离心5min，弃上清，预冷的5ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。
l 离心5min，弃上清，预冷的1ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。
2）准备培养细胞。（注意：本protocol通常处理50ml培养细胞。单层细胞，切勿胰酶消化！用0.2%EDTA/PBS溶液代替。1×PBS洗细胞1次。）
l 血球计数仪计数细胞。
l 1000rpm离心5min，弃上清，用足够的1×PBS轻轻重悬沉淀至终浓度为1×107细胞/ml。

l 各管加入荧光染料标记的第一抗体或isotype control。（20μl/106细胞。滴定抗体确定最佳浓度）。
l 每管加入100μl RBC溶解的全血或单细胞悬液。混匀，放在有盖的冰盒内孵育15-30min。
l 每管加入1.5ml FCM冲洗缓冲液（sc-3624），颠倒混匀。1000rpm离心5min，弃上清，500μl 1%多聚甲醛重悬沉淀。
l 测读分析数据。

细胞内染色

l 可用适当的活性物质刺激细胞。确保有未刺激细胞对照。
l 50ml离心管收集细胞。2000rpm离心5min，弃上清。
l 室温1×PBS 20ml重悬细胞。
l 细胞计数。
l 2000rpm离心5min除去PBS。4℃1×PBS洗1次。2000rpm离心5min除去PBS。
l 每106个细胞加入1ml 4℃ FCM固定缓冲液（sc-3622），冰育15-30min。
l 4℃1×PBS洗细胞2次，离心，弃上清。
l 每106个细胞加入1ml -20℃ FCM渗透缓冲液（sc-3623），逐滴加入混悬。冰育15min。
l 离心；4℃ FCM冲洗缓冲液（sc-3624）。
l 2000rpm离心5min，弃上清。每107个细胞加入1ml FCM冲洗缓冲液，然后等分细胞（106）至各待测管中。
l 细胞内着染：各管加入荧光染料标记的第一抗体或isotype control。室温避光孵育1hr。

注意：为得到最佳结果应滴定荧光染料标记抗体。

l 1ml FCM冲洗缓冲液洗细胞2次， 500μl新鲜FCM冲洗缓冲液重悬。
l 24hrs内检测分析。

8．ELISA检测

l 包被微孔板，靶蛋白用50mM碳酸盐包被液（pH9.0）稀释。最佳包被浓度须经滴定，但纯化抗原通常为1μg/ml，50μl/孔。封好，4℃过夜孵育。
l 弃净液体。加入200μl/孔封闭液（含1%BSA和0.02%叠氮钠的PBS）封闭非特异结合位点。室温孵育1-2hrs或4℃过夜孵育。
l 弃净液体。含0.02%叠氮钠的PBS洗1次。湿润的微孔条可用塑料密封袋密封，4℃保存4周。用前，弃净多余的液体。
l 加入50μl/孔封闭液稀释的待测样品和对照。抗体需梯度稀释测定滴度或用以前的工作浓度作筛选或半定量。室温孵育1hr。
l 含0.05%Tween-20（sc-29113）的PBS洗板3次，弃净液体。
l 加入50μl/孔封闭液稀释的1:100-1:1000的碱性磷酸酶标记抗体。最佳抗体浓度需滴定决定。室温孵育1hr。
l 弃净液体。含0.05%Tween-20的PBS洗板3次，拍干，弃净液体。
l 乙醇胺缓冲液（10mM乙醇胺，0.5mM MgCl2（sc-29098），pH9.5）洗1次，弃净液体。
l 用乙醇胺缓冲液稀释底物（PNPP，sc-3720）至终浓度1mg/ml。加入50μl/孔。反应10-20min直到阳性对照OD405/490读数达1.0。加入50μl/孔0.1M EDTA，pH7.5终止反应。OD405/490读数。

9. TRANSCRUZTM 超凝胶迁移检测

l 用多聚核苷酸激酶将[γ32p]-ATP 标记到寡核苷酸上，达到50,000cpm/ng
l 准备胶迁移缓冲液：10mMTris,Ph7.5, 50mMNaCL,1mMDTT,1mM EDTA,5%甘油
l 准备20ul的反应混合物，将3-10ug核抽提物，和1ug多聚dIdC溶解在20ul胶转移缓冲液中。加0.5ng标记的寡核苷酸探针，室温孵育20分钟。这组成了检测DNA-蛋白复合物的对照样品
l 为了检测抗体迁移或封闭DNA-蛋白复合物，按步骤3准备反应混合物，每20ul反应体积加1-2ul TransCruzTM 超凝胶迁移抗体。一般是在加了探针之后，才加抗体，但在加探针前加入抗体，可使结果加强
l 通过4% 聚丙烯酰胺凝胶电泳（25-30ma）,分开DNA和蛋白复合物。凝胶中含50mMTris,Ph7.5, 2mM EDTA,0.38M甘油.待胶干后，自动放射显影查看结果


10. 肽的中和

l 对所有的santa cruz的亲和纯化的兔或山羊的多抗和单抗，都有相应的封闭肽做对照。通过将抗体和封闭肽的预先孵育，抗体对抗原的结合可以被阻止。
l 决定最高的抗体稀释度，在这个稀释度下，可以一直获得理想的阳性结果。例如，H-Ras在免疫沉淀时，推荐的浓度是1ug/ml,但阳性结果是在50ng/ml。
l 封闭/竞争时，将抗体（抗体浓度按照以前提到的方法确定）和5倍重量的封闭肽混合在500ul的PBS中，室温孵育2小时，或4度过夜。
封闭/竞争后，用封闭缓冲液稀释抗体/封闭肽混合物，然后，按照所期望的实验的操作进行。

嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司,免费热线:400-698-4168。 业务咨询 QQ :1213084081