Santa Cruz公司产品Protocols及相关支持产品（三）_试剂_供应

货号：	暂无
供应商：	Santa Cruz
数量：	大量
保质期：	1年

11. 染色质免疫沉淀

注意：CHIP的实验步骤可以有很多不同版本，下面介绍的步骤适合大多数的实验
l 常温下，用PBS洗细胞，重悬细胞，使细胞数大约5*105个/ml（总细胞数2*107）。,
加甲醛，使终浓度为1%，室温孵育10分钟。
l 加甘氨酸至终浓度0.125M，终止交联反应
l 2000rpm,5分钟，离心细胞。用冷的PBS洗细胞一次
l 用6ml的裂解缓冲液重悬细胞，轻柔混合，2000rpm离心5分钟，收集粗提的核提取物。
l 再用PBS洗沉淀，沉淀可以冻存，或继续以下步骤。
l 用1.9ml的高盐裂解缓冲液重悬沉淀，转移到2ml的离心管中准备超声
l 超声条件需要优化，下面介绍的条件是在使用Sonics VC130和3mm的探头的基础上建立起来的：
l 在冰上操作，输出功率设置5（R）6,每隔30秒超声一次，共4次。
l 4°C，10，000rpm 离心15分钟，保存上清，确定上清中蛋白的浓度。
l ，如果免疫沉淀，我们推荐100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz试剂（0.2—2ug）
l 注意：研究者可能希望使用连接有葡聚糖或磁珠的一抗，以便于选择后续免疫沉淀的试剂。有些情况下，将针对同一种蛋白不同表位的抗体联合使用会更好。
l 向染色质溶液加50ul Protein A/G-琼脂糖，4度，孵育30分钟，使其澄清，最大速度，4度离心5分钟。
l 向上清中加一抗，4度孵育过夜。
l 加50ul Protein A/G –琼脂糖，4度孵育2小时。
l 12，000rpm离心20秒收获磁珠，并将管放在冰上
l 用1ml裂解缓冲液洗磁珠2次
l 用冲洗缓冲液洗磁珠四次
l 重悬磁珠在400ul洗脱缓冲液中
l 通过在67度水浴中孵育管子2小时以上，使反向交叉连接
l 离心去除磁珠，继续在67度水浴孵育上清过夜 Remove
l 10,000rpm离心3分钟去除残留的珠子，保留上清
l 分离DNA,用500ul 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提上清,剧烈振荡，14,000rpm离心3分钟分离两相。
l 保留水相，用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE)  反向抽提有机相一次，在汇集水相
l 用600ul 氯仿/异戊醇抽提汇集的水相
l DNA可以用商业化的试剂盒浓缩。

12. siRNA小干扰RNA

转染
l 第一天：准备细胞
健康的细胞是成功转染的要求，在转染前明确细胞的生存状态
对于贴壁细胞：
1，吸弃培养基，用胰蛋白酶、EDTA、或其他合适的方法分散细胞，在胰蛋白酶化前，用无菌的1X PBS漂洗细胞2次。
2，一旦细胞分散，用4倍体积的含10% 胎牛血清不含抗生素的生长培养基（如DEME,RMPI1640）稀释悬浮液。
（注意：这个阶段使用不含抗生素的培养基是转染成功的关键）
3，1,000 rpm离心5分钟，去除培养基，用不含抗生素的培养基重悬沉淀
4，转移细胞到12孔的细胞培养板以便细胞过夜培养后，细胞覆盖率达60-80%
（注意：细胞覆盖率也是成功转染的关键）
对于悬浮细胞：
1，1,000 rpm离心5分钟
2，去除培养基，用不含抗生素的含10% 胎牛血清的培养基重悬沉淀
3，转移细胞到12孔的细胞培养板或转到多聚赖氨酸包被的8孔板中，以便细胞过夜培养后，细胞覆盖率达60-80%
（注意：多聚赖氨酸包被是使悬浮细胞黏附到板底必须的）
l 第二天
准备转染试剂和转染
注意：对于不同的实验目的有不同的操作步骤，请根据试验需要选择下面介绍的操作步骤。
l 对于蛋白和转录检测
注意：当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时，转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。
1，对每一次转染，在一个无菌的小管里准备下面的混合物这一步无关细胞培养类型
(A) 加3.6ul 10uM的siRNA到40ul siRNA转染培养基中，轻柔混合，在室温中放置15分钟（注意：如果需要低浓度的siRNA，用siRNA稀释缓冲液进行稀释）
（B）加2.4ul siRNA转染试剂到40ul的siRNA转染培养基中，轻柔混合，室温放置5分钟。
注意：虽然siRNA转染试剂对许多细胞都有很高的转染效率，但并不是适用于所有的细胞
2， 5分钟后，混合A和B形成siRNA-siRNA转染试剂混合物，轻柔混合，室温孵育20分钟。
3，然后，向每个含有siRNA-siRNA转染试剂混合物的管中加入0.32ml的siRNA转染培养基，轻柔混合
对贴壁细胞：
    4.1转染前，吸弃培养基，用1ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次，弃培养基。
4.2在洗过的细胞上，铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物，37度，5-7小时
4.3孵育后，向含有转染细胞的每个孔中加0.4ml 生长培养基，其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍，无需去除转染混合物。如果，毒性是个问题的话，去除转染混合物，以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时
4.4孵育结束后，用新鲜正常生长培养基替换，继续孵育24-72小时
4.5从细胞中吸弃培养基，用1ml 1*PBS洗细胞一次，然后丢弃
4.6放置在冰上，向孔中加入300ul 1*电泳缓冲液，用移液器吹打，混匀。（注意：混合物可能变得粘稠）
如果进行Western blot的话，转移混合物到15ml的锥形管中，放在冰上，对混合物进行超声波降解，每15秒一次，用输出功率的40%。如果，超声后，起很多泡泡，1000转/秒，离心3分钟，然后，按照western blot的方法进行电泳，免疫印迹。
如果做转录分析，按照我们的半定量RT-PCR的操作进行。
对悬浮细胞
4.1在转染前，1000转/秒，离心5分钟收集细胞。去除培养基，用1ml 无菌的siRNA转染培养基。
4.2 再次离心1000转/秒，5分钟，去除培养基。用稀释的siRNA-siRNA转染试剂复合物重悬细胞。转移细胞到12孔组织培养板，37°C孵育5-7小时，每次单独转染时重复。
4.3孵育后，加0.4ml含2倍正常血清和抗生物浓度的生长培养基到每个含被转染细胞的孔中，不要去除转染混合物。如果有毒性的话，去除转染混合物，代替以正常生长培养基，在额外孵育18-24小时。
4.4一旦孵育结束，离心细胞，去除培养基。用新鲜的正常生长培养基重悬细胞。转移细胞到12孔组织培养板，继续孵育24-72小时。
如果  需要做western blot分析，则继续以下步骤
转移混合物到15ml的锥形管中。将2*电泳上样缓冲液用Milli-Q超纯水稀释到1* 。1000转离心5分钟，收集细胞，去除培养基，用1ml PBS洗细胞，重复一次，用300ul 1*电泳上样缓冲液重悬细胞，放在冰上，对混合物进行超声波降解，每15秒一次，用输出功率的40%。如果，超声后，起很多泡泡，1000转/秒，离心3分钟，然后，按照western blot的方法进行电泳，免疫印迹。
如果需要转录分析，参照半定量RT-PCR步骤。

l 免疫荧光检测
注意：当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时，转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。
1，准备以下混合物：
（A）加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA转染培养基中，轻柔混合，在室温放置5分钟  注意：如果需要低浓度的siRNA，用siRNA稀释缓冲液稀释
（B）加1.2ul siRNA转染试剂到20ul siRNA转染培养基中，轻柔混合，室温放置5分钟。注意：虽然，对多种的细胞系有很高的转染效率，但siRAN转染试剂并不是对所有细胞都适合。
2，5分钟后，混合A和B，形成siRNA-siRNA转染试剂复合物，轻柔混合，室温孵育20分钟。
3，孵育后，加160ul siRNA转染培养基到每个含有siRNA-siRNA转染试剂复合物的管中，轻柔混合
  从这一步起，对悬浮细胞和贴壁细胞的处理方法相同
4，转染前，吸弃培养基，用0.3ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次，去除培养基。
5，在洗过的细胞上，铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物，37度，5-7小时
6，孵育后，向含有转染细胞的每个孔中加200ul 生长培养基，其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍，无需去除转染混合物。如果，毒性是个问题的话，去除转染混合物，以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时
7,孵育结束后，用新鲜正常生长培养基替换，继续孵育24-72小时
8,使用恰当的操作步骤检测细胞，参见免疫荧光染色步骤

13. 半定量RT-PCR

l cDNA合成
准备试剂：1ul oligo(dT) 12-18(500 µg/ml)
1 ng-5 µg 总 RNA
1 µl 10 mM dNTPs
用不含RNA酶的去离子水补加到总体积12 µl
70℃ 孵育 5 分钟，迅速放在冰上，再加入
4 µl 5x反转录酶缓冲液
2 µl 0.1 M DTT
1 µl RNase 抑制剂
42℃孵育 2 分钟。
加1 µl 反转录酶(200 units)
  42℃ 孵育 50 分钟，然后，
在70℃孵育15 分钟终止反应
注意：作为优化的步骤，加1 µl RNase H (2 unit/µl)
37℃ 孵育20分钟

l 第一轮PCR 反应：
准备以下试剂
5 µl 10x PCR 缓冲液（含或不含MgCl2)
*5 µl 25 mM MgCl2 (调整不同的MgCl2浓度,推荐终浓度 2.5 mM)
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物对 A
1 µl Taq DNA 聚合酶
2 µl cDNA 加水使体积达到50 µl
94℃孵育 2 分钟，变性 cDNA.
进行的15–40 个循环的 PCR.退火和延伸反应是根据引物和模板情况依经验而确定的。

l 第二轮 PCR 反应
准备以下试剂
5 µl 10x PCR 缓冲液（含或不含MgCl2)
*5 µl 25 mM MgCl2 (调整不同的MgCl2浓度,推荐终浓度 2.5 mM)
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物对 B
1 µl Taq DNA 聚合酶
1–5 µl 第一次PCR 产物，并补加水到50 µl
94℃孵育 2 分钟变性 cDNA.
进行的15–40 个循环的 PCR.退火和延伸反应是根据引物和模板情况依经验而确定的。
PCR产物在琼脂糖凝胶中，EB染色后可见。

14. 通用溶液

试剂	成分	备注
_Tris 缓冲液(1x TBS)	10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl
磷酸缓冲液 (1x PBS)	9.1mM 磷酸二钠盐, 1.7 mM 磷酸一钠盐，150 mM 氯化钠	用NaOH.调 pH to 7.4
电泳上样缓冲液 (2x)	1.0 ml 甘油, 0.5 ml â-巯基乙醇,3.0 ml 10% SDS, 1.25 ml 1.0 M Tris-HCl, pH 6.7 和 1–2 mg 溴芬兰，冻存	也可选择没有巯基乙醇的缓冲液，室温存储，使用前加巯基乙醇
DAB	溶解 5 mg DAB在100ml 100mM Tris-HCl, pH 7.6,加0.1 ml 0.3% 过氧化氢	每次准备新鲜的DAB溶液
_RIPA溶液	1x PBS, 1% 湿润剂Nonidet P-40 或表面活性剂Igepal CA-630, 0.5% 正钒酸钠, 0.1% SDS	使用时加入抑制剂如下： 1) 10 mg/ml PMSF (sc-3597) 加入剂量10 µl/ml RIPA 2) Aprotinin (sc-3595) 加入剂量 50 KIU/ml RIPA 3) 100 mM sodium orthovanadate 加入剂量10 µl/ml RIPA
Subbing solution	0.3% (w/v) 明胶,0.05% 硫酸铬钾
封阻液A	1x TBS, 5% milk, 0.05% Tween-20	一般使用
封阻液 B	1x TBS, 1% milk, 1% BSA, 0.05% Tween-20	适用于所有的磷酸化特异抗体的检测向封阻液中加入 50 mM NaF 抑制磷酸酶活性。