货号: | YB40775ES50 |
生长状态: | 贴壁生长 |
运输方式: | 干冰运输 |
器官来源: | 咨询 |
是否是肿瘤细胞: | 咨询 |
细胞形态: | 上皮样 |
免疫类型: | 咨询 |
物种来源: | 咨询 |
相关疾病: | 咨询 |
组织来源: | 咨询 |
供应商: | 上海钰博 |
数量: | 1000 |
Indo-1是一种细胞生物学常用的钙离子荧光探针,与Fura-2为目前使用最广泛的比率法测定的钙荧光指示剂,Indo-1能特异性地结合Ca2+,同时可发出荧光,结合Ca2+后的最大发射波长从结合前的475nm向400nm(Ca2+饱和时)偏移,该信号变化可被流式细胞仪较好的捕捉:在氩离子激光器的351-364光谱范围内单一波长激发该探针,在400nm和475nm的波长处分别检测结合钙离子和未结合钙离子的荧光信号,通过二者荧光强度的比率测定钙离子浓度。
由于Indo-1是极性大的酸性化合物,无法进入细胞内,为此在其负性基团上结合乙酰氧甲酯,使其成为Indo-1/AM,该变化既增加了酯溶性又消除了负电荷,极大的提高了细胞渗透性。在细胞内,Indo-1/AM被酯酶水解成Indo-1后可与胞浆游离Ca2+可逆性结合。
Indo-1, AM,Cell Permeable 细胞可渗透钙离子荧光探针产品性质
CAS号(CAS NO.)
112926-02-0
分子式(Formula)
C47H51N3O22
分子量(Molecular Weight)
1009.91
Ex/Em
346nm/475nm
溶解性(Solubility)
溶于DMSO
结构式(Structure)
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃避光干燥保存,有效期6个月。
注意事项
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
需要试剂准备
1) (可选)配制Pluronic F-127母液:100mg Pluronic F-127粉末(Cat No. 60318ES60)中加入0.5ml DMSO,配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存,不要冷藏。如果有结晶析出,可以重新加热后溶解,不影响使用。
2)Hanks•balanced salt solution(HBSS)
Indo-1, AM,Cell Permeable 细胞可渗透钙离子荧光探针使用方法(本实验方案仅供参考,为得到最理想实验结果,需根据具体的实验情况优化实验条件。)
1)Indo-1/AM储存液的配制
利用高质量无水DMSO溶解Indo-1/AM配制成2-5mM的储存液,该储存液可分装于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回温至室温。
【注】:① 因为Indo-1/AM在水中的溶解性和稳定性较差,不可用水溶性缓冲液配制Indo-1/AM储存液。
② 溶解用的DMSO需要保证新鲜无水,否则将会导致AM 体水解,使荧光染料无法进入细胞,影响实验效果。
2)Indo-1/AM工作液的配制
利用合适缓冲液(如Hanks & Hepes )将Indo-1/AM稀释成1-10μM的工作液,具体稀释方法如1 mM母液配制1 ml浓度为4 µM工作液,用1 ml 缓冲液稀释4 µl 1mM母液即可,混匀。
【注】:① 典型工作液浓度为0.1-5μM,对于大多数细胞,我们推荐加载浓度4-5μM,具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性,建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
② Indo-1/AM工作液需现配现用,避免反复冻存。
3)(可选)如果Indo-1/AM进入细胞的效果不好,可向 Indo-1/AM/DMSO 储存液中加入适量20% Pluronic F127溶液,最终稀释至其终浓度为0.02-0.05%,Pluronic F127 可以防止 Indo-1/AM在缓冲液中聚合并能帮助其进入细胞。
【注】:Pluronic F127可降低Indo-1/AM的稳定性,因此只建议在配制工作液时加入,不建议将其加入储存液长期保存。
4)取出预培养的细胞,除去培养基,使用缓冲液洗涤细胞3次。
【注】:如果使用含血清的培养基,血清中的酯酶会分解 AM 体,从而降低Indo-1/AM进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高,所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。
5)将 Indo-1/AM工作液加入细胞,加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养15-60min,然后除去Indo-1/AM工作液。
【注】:关于孵育的时间,如果首次做实验不能确定,建议先孵育30min,看荧光效果:如果细胞死亡较多,适当缩短时间;如果荧光强度太弱,适当延长时间。
6)用不含探针缓冲液洗涤细胞 3 次,以充分去除残留的Indo-1/AM工作液。然后加入缓冲液覆盖细胞。
7)37℃培养箱孵育约 20-30min,以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。
8)流式细胞仪检测细胞。
【注】:① 某些细胞会将荧光探针被动运输或分泌到胞外,在一些通过阴离子泵泄漏探针的细胞内该现象尤其严重,此时需加入一些抑制剂防止该情况的发生,如加入适量的丙磺舒或磺吡酮。但需注意,抑制剂的加入量必须经过优化,过量的抑制剂也会对细胞造成不利影响。
② 某些细胞具有自体荧光会影响结果分析,需使用未加载探针细胞做对照,在结果分析时在同一波长下扣除自荧光。
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