人骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒

产品介绍

间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞，2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。

为方便科研用户鉴定MSC的分化能力，麒盟干细胞研究中心精心优化MSC成软骨诱导分化试剂盒，其中包括成软骨诱导培养体系和鉴定所需要的染色液，让用户可以稳定有效地鉴定MSC的分化潜能。该试剂盒提供的实验方法为常规鉴定方法，用于鉴定MSC是否具有成骨分化能力。除此以外，试剂盒的诱导培养基还可用于诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、免疫组化检测等。但若用于免疫荧光检测需注意自发荧光或固定方法问题。

本产品仅适用于科研。
产品信息
产品名称：人骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒
货号：CHEM-200003
批号：见包装
试剂清单：
 

存储与有效期：
A、G、I液于2-8 ℃避光保存，其余溶液于-20 ℃（或更低温度）避光保存。所有组分均需要避免反复冻融及复温，I液有效期为6个月，其他组分在所需要的温度下有效期为1年。预混液于2-8 ℃保存，有效期为1个月，完全培养基现配现用。
产品介绍
人骨髓间充质干细胞（hBMSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。
为方便科研用户鉴定hBMSC的分化能力，麒盟干细胞研究中心精心优化hBMSC成软骨诱导分化试剂盒，其中包括成软骨诱导培养体系和鉴定所需要的染色液，让用户可以稳定有效地鉴定hBMSC的分化潜能。该试剂盒提供的实验方法为常规鉴定方法，用于鉴定hBMSC是否具有成骨分化能力。除此以外，试剂盒的诱导培养基还可用于诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、免疫组化检测等。但若用于免疫荧光检测需注意自发荧光或固定方法问题。
本产品仅适用于科研。
操作方法
实验准备
²  试剂配制：
预混液：室温融化B-G溶液各一支，将融化的溶液B-G加入A液中，晃动培养基使其充分混匀，配制成软骨分化培养基预混液。
注意：溶液溶解后旋涡混匀、1000 g短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入A液后，吸取A液洗涤溶液瓶两次，将洗涤液加入A液中。所有液体混合成预混液必须充分混匀，2-8 ℃保存。
TGF-β3分装：室温溶解H液，根据每次换液需要的试剂量分装成小份，-20℃或更低温度保存。
诱导完全培养基：按照当次所需要的诱导液总量取相应的预混液与离心管中，加入相应量的TGF-β3，充分混匀制成诱导完全培养基，此液现配现用。1ml预混液需添加TGF-β3的量为10 μl。
注意：H液可以根据需要分装成不同小份，-20℃或更低温度保存，每次使用时按照当次使用的量配制诱导完全培养基，完全培养基必须现配现用。整个过程需无菌操作，适当以75%酒精擦拭表面。
²  自备试剂：
l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA）
l  磷酸盐缓冲液（DPBS）
l  hBMSC完全培养基
l  4%中性多聚甲醛溶液
注意：若hBMSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。hBMSC消化极易过度，建议稀释消化液一倍，且严格控制消化时间。
操作步骤
1.      准备所需诱导分化的hBMSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。
2.      150g离心5min，沉淀以预混液重悬，细胞密度约1×10⁶cells/ml，再次离心，弃上清。
3.      沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为5×10⁵cells/ml。
4.      分别取500μl细胞悬液接种于15ml离心管中，150g离心5min。
注意：成软骨诱导时每管细胞的总数在5×10⁴至3×10⁵之间，细胞数过少形成的软骨团块可能较小，细胞数过多则倾向于分开成块。正常情况下可形成1mm³的团块。
5.      旋松离心管盖，将离心管轻轻置于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养。
注意：24 h内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。
6.      诱导培养24h后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续培养。
注意：细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定，基本在24-48h之间，以细胞团周围有聚拢现象时为准。
7.      每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸取旧培养基，每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500μl。
注意：换液时动作轻柔，以免吸出软骨团块；诱导液必须经过复温，否则影响诱导效果。在诱导培养2-3周后会出现大量细胞外基质，富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。
8.      诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。
注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。
9.      弃去固定液，DPBS洗2次，脱水、石蜡包埋后切片。
注意：脱水包埋可以用擦镜纸包裹后使用自动脱水机脱水、包埋，也可以在原离心管中逐级更换脱水、透蜡的液体，手工包埋。过程中一定注意团块不要丢失。
10.  阿利新蓝染色：将切片进行脱腊和复水，阿利新蓝染液染色30min，流水冲洗5min，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。
注意：染色和制片过程中避免干片，干片后会导致组织形态发生变化，影响观察、拍照效果。根据需要可以选择苏木素复染。
11.  结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的hBMSC具有成软骨能力。否则，所使用的hBMSC无成软骨能力。

 
结果展示

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