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抗体人源化

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中国北京
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2021-03-17 01:30:01
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产品详情

品牌名称:
提供商: 艾柏森(北京)生物科技有限公司

抗体人源化
 

       抗体人源化改造是增加异源抗体中人源序列比率的过程。随着杂交瘤技术的发展,大批的与抗原有特异亲和力的异源(通常是鼠源)抗体引起了人们的兴趣,但是由于HAMA效应的存在,大大限制了这些抗体在临床上的应用。而且这些异源抗体往往半衰期短,且能引起机体的炎症效应。抗体人源化的过程就是解决异源单克隆抗体免疫原性,改善抗体对人体免疫系统的活化作用。

       艾柏森生物拥有丰富的抗体人源化经验,我们利用多种策略进行抗体的人源化改造,可以在保留抗体特异性的同时,大部分或者全部消除异源抗体在人体内的免疫原性。其中包括重构抗体、链替换抗体及表面重塑抗体等,通过建立噬菌体展示的人源化突变库,筛选出高亲和力的人源化抗体,也可以通过哺乳动物细胞表面展示技术建立人源化的IgG库,通过FACS分类筛选。

艾柏森生物的人源化策略

抗体测序——同源建模——CDR移植——设计改造

 
服务流程:

 

 

技术流程:

    艾柏森生物提供的抗体人源化策略包括:CDR&SDR移植、链替换及人源IgG抗体库筛选。抗体亲和力成熟策略包括:随机突变、定点突变等多种突变方式,结合专有人类抗体数据库、电子建模等技术。

 

CDR移植抗体构建流程

1. 质控

对客户提供的亲本抗体做活性验证,确认是否有必要进行人源化改造。

2. 抗体基因获得

提取杂交瘤细胞中mRNA,反转录为cDNA,PCR扩增VH和VL链,测序。

3. 生物信息学方法设计人源化方案

3.1 分析亲本抗体VH和VL序列,进行亚型分类、计算机模拟抗体结构分析及多序列比对进行CDR区和FR区定位,确定FR区保守氨基酸及关键氨基酸残基及其位置。

a. V区、CDR及FR序列的确定


 


 

       利用序列相似性搜索方法确定恒定区(CH和Cκ),然后找到序列引物,之间即为V区。将V区基因序列翻译为氨基酸序列,通过Kabat数据库和Swiss-Port数据库比较,确定CDR和二硫键位置。
 

表1 h-TNFα鼠单抗CDR和FR确定
 

*代表二硫键的Cys位置

b. 抗体V区结构同源建模及抗原抗体复合物模型构建

01. 模板蛋白的选择


       利用PDB数据库,搜索抗体V区同源蛋白,从而确定模板蛋白结构和序列,如表2。

 



 


02. SCR和Loop区的确定

    利用Structure Superimpose法对模板蛋白进行结构相似性分析,确定模板蛋白的结构保守区(SCR)和无规则环区(Loop)。通过多序列比对,确定目的蛋白的SCR和Loop。


 


 

03. 抗体VH和VL初始结构的获得


 


 


04. 初始结构构象优化及分子动力学模拟

       首先用Insight Ⅱ(2000)中Rotamer软件对模型构象的二面角调整,再用Discovery软件,在CVFF、Gromos力场下,经最陡下降、共轭梯度、牛顿力学等步骤对抗体V区构象进行优化。再通过动力学优化,获得稳定的空间构象。见图1。


 



图1 经过分子模拟、力学优化、动力学模拟获得抗体VH和VL碳原子空间构象


 

05. 抗体V区空间构象合理性判断

    利用Ramachandran图对获得的抗体可变区构象进行评价,如图2所示,不同颜色代表了氨基酸残基构象的合理程度。红色代表残基构象匹配最佳,深黄色表示残基构象允许区,土黄色表示构象可以,白色表示构象存在较大误差。

 



图2 利用Ramachandran图对抗体的V区残基进行构象评估



 

06. 抗体可变区Fv构象的获得

    选择同一个包含VH和VL的构象的模板为参考,考虑VH和VL相互作用模式,分析可及性表面是和表观静电分布情况,利用Molecular Docking的方法获得抗体V区构象。


 




图3 抗体可变区的空间构象



 


07. 抗原-抗体复合物模型的建立

    抗原-抗体相互作用复合物结构是合理判定抗原表位、抗体合理改造与设计的基础。利用Molecular Docking方法,探讨抗原-抗体相互作用,确认二者相互识别过程中静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华力作用等,预测二者的结合模式和亲和能力,从而进行抗原表位合理预测、抗体人源化和亲和力改造。


 




图4 利用分子对接方法建立抗原-抗体复合物结构模型

 

08. 抗体FR区中重要氨基酸残基的确定


       利用SAS方程,计算可及性表面积;利用Delphi程序,计算表观静电分布。基于以下原则确定抗体FR区中重要氨基酸残基:

 



3.2通过Kabat、Genebank和IMGT等数据库检索比对和辅助计算机分子模拟,寻找最大同源性的人FR区模板,设计CDR移植scFV,进行计算机结构模拟分析。


a. 人源抗体模板的选择及FR区保守氨基酸的确定


    在NCBI网站,运行IgBLAST,通过BlastP程序,检索人源库中鼠抗体V区同源序列,通过序列比对归纳出人抗体FR中高频率出现的氨基酸残基及位置。


 


b. 鼠源抗体人源化过程中需要改变的残基确定


    根据可及表面积、表观静电分布及序列比对的结果,确定人源化过程中需要改变的氨基酸残基。

 


 


c. 点突变的Fv空间结构模拟


    利用计算机建模、力学优化及动力学模拟得到人源化抗体的V区构象,通过结构叠合进行亲本抗体和人源化抗体的构象比较。


d. 人源化后抗体活性预测


    借助Molecular Docking和动力学模拟优化人源化后抗体-抗原复合物的结构,通过相互作用能、分子间氢键以及识别表位,从理论上评价异源抗体人源化后的生物学活性。


3.3表达重构抗体和亲本scFV抗体


    根据计算机模拟设计的人源化方案,合成基因,表达48-126个重构抗体,分别测定其与抗原的相对结合活性。测定亲本scFV抗体亲和力,挑选亲和力最佳的人源化抗体克隆,进行亲和力成熟改造。

网址:

       http://www.abiocenter.com/h-col-249.html

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