IBA-Tet启动子Strep-tag II/6xHistidine-tag双标记表达载体(2-1301-000)

Tet表达系统

特点和优点：
•以pASK-IBA载体在大肠杆菌中高水平表达
•由于tet启动子而使表达受到紧密调控
•增加细胞毒性基因的稳定性
•通用的克隆策略，只需一个限制性内切酶
•N-端或C-端Strep-tag II融合
•N-端或C-端6xHistidine-tag融合
•Strep-tag II/6xHistidine-tag双标记载体
•胞液或外周胞质中表达
•无水四环素（anhydrotetracycline，AHT）诱导表达
•氨卞青霉素或氯霉素抗性
原理和特性：
　　pASK-IBA载体与受紧密调控的tet启动子一起工作。tet抑制子在pASK-IBA质粒上编码，并分别从beta-内酰胺酶启动子或氯霉素乙酰基转移酶启动子组成型表达。这种特殊的安排保证了抑制分子和质粒拷贝数之间平衡的化学计量。在低浓度无水四环素的有效化学诱导下，外源基因表达受到的严格抑制才得以解除。与lac启动子（有漏洞、易受分解代谢产物（cAMP水平，代谢状态）的抑制以及受染色体编码的抑制分子的影响）相比，tetA启动子/操纵子受到紧密调控，不与任何细胞调节机制或遗传背景有功能上的偶联。
　　因此，无需特殊大肠杆菌菌株或额外质粒，多种培养基和培养条件下都可以应用。例如，葡萄糖基础培养基甚至XL 1-Blue菌株（携带四环素抗性基因的一个附加拷贝），也可用于表达。pASK-IBA表达系统在发酵等多种条件下非常稳定，操作方便。
　　细胞质pASK-IBA载体现以“plus”版本提供。这种新版本包含改良的翻译起始位点以增加一级蛋白质产量，而“plus”载体（如pASK-IBA3plus）的其余序列与其“非plus”前体（如pASK-IBA3）相同。“非plus”版载体从现在开始仅按需供应。
　　载体的更多元件包括一个前后串联的核糖体结合位点（RBS），保证翻译的有效起始；脂蛋白基因的强终止子，以避免通读；噬菌体f1的基因间区域，以提供一种制备单链DNA的方法；以及一个beta-内酰胺酶或氯霉素乙酰基转移酶基因*。这些载体均不介导抗四环素抗性。
使用带beta-内酰胺酶抗性基因的克隆载体可能会有某些局限性，因为氨苄青霉素在细菌培养基里降解的相当快。因此，我们现在以氯霉素抗性取代氨苄青霉素抗性供应Strep-tag II载体pASK-IBA2C至pASK-IBA7C。
　　以下大肠杆菌菌株已与pASK-IBA载体一起成功用于Tet表达：JM83, WK6, B, BL21, MG1655, W3110, BL21(DE3), BLR(DE3), XL1-Blue, BL21-CodonPlusTM-RIL
　　对于分泌型蛋白，我们推荐JM83。对于胞质表达我们推荐大肠杆菌B菌株，因为它们缺乏离子蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，后两者能在纯化过程中降解蛋白质（Grodberg and Dunn, 1988, J.Bacteriol. 170, 1245）。
请注意我们不知道有与Tet表达系统不兼容的大肠杆菌菌株。

无水四环素：tetA启动子诱导剂
　　Strep-tag/Strep-Tactin 过度表达系统的大肠杆菌表达框受tetA启动子/操纵子和抑制子的转录调控。启动子被低浓度无水四环素（AHT）诱导,既节省费用也使AHT的抗菌影响降到最低。Degenkolb 等 (1991) 研究表明，AHT 对tet抑制子的结合比四环素对tet抑制子的结合紧密35倍。
Strep-tagÒ 载体概览：
　　IBA提供多种用于在大肠杆菌中表达的pASK-IBA载体以便携带有Strep-tag的重组蛋白表达。除了抗生素抗性基因（AmpR, CamR），pASK-IBA载体仅在XbaI和HindIII限制性酶切位点之间有区别。其区别如下图所示：您可以在N-或C-端标签之间、细胞质外周表达或细胞质表达之间和/或用以去除标签的内蛋白酶切割位点（Factor Xa, enterokinase, thrombin 和 TEV protease）之间作选择。请注意，通常无须去除标签。

双标签和6xHistidine-tag载体概览：
　　除了Strep-tagÒ 载体，IBA还提供带有Strep-tag和6xHistidine-tag的双标签载体以及6xHistidine-tag载体。一个蛋白质上的两个不同标签能产生最高的纯化因素，使得可以在变性或生理条件下纯化全长蛋白质。而且，直接从培养基开始的纯化操作可以被优化。
　　载体仅在XbaI和HindIII限制性酶切位点之间有区别。

质粒 Strep-tag 6xHis-tag HA epitope-tag 分泌 Tag去除 蛋白酶 抗性 目录号

大肠杆菌载体:具有tet启动子用于胞质外周表达
pASK-IBA2 C-端 - - Yes No - Amp 2-1301-000
pASK-IBA4 N-端 - - Yes No - Amp 2-1303-000
pASK-IBA6 N-端 - - Yes Yes factor Xa Amp 2-1305-000
pASK-IBA12 N-端 - - Yes Yes thrombin Amp 2-1311-000
pASK-IBA14 N-端 - - Yes Yes enterokinase Amp 2-1313-000
pASK-IBA32 - C-端 - Yes No - Amp 2-1332-000
pASK-IBA44 N-端 C-端 - Yes No - Amp 2-1344-000
大肠杆菌载体:具有tet启动子用于细胞质表达
pASK-IBA3plus C-端 - - No No - Amp 2-1402-000
pASK-IBA5plus N-端 - - No No - Amp 2-1404-000
pASK-IBA7plus N-端 - - No Yes factor Xa Amp 2-1406-000
pASK-IBA13plus N-端 - - No Yes thrombin Amp 2-1412-000
pASK-IBA15plus N-端 - - No Yes enterokinase Amp 2-1414-000
pASK-IBA17plus N-端 - - No Yes TEV protease Amp 2-1416-000
pASK-IBA33plus - C-端 - No No - Amp 2-1433-000
pASK-IBA35plus - N-端 - No No - Amp 2-1435-000
pASK-IBA37plus - N-端 - No Yes factor Xa Amp 2-1437-000
pASK-IBA43plus C-端 N-端 - No No - Amp 2-1443-000
pASK-IBA45plus N-端 C-端 - No No - Amp 2-1445-000
pASK-IBA63a-plus C-端 - - No No - Amp 2-1463-100
pASK-IBA63b-plus C-端 - - No No - Amp 2-1463-200
pASK-IBA63c-plus C-端 - - No No - Amp 2-1463-300
pASK-IBA65b-plus N-端 - - No No - Amp 2-1465-200
大肠杆菌载体:具有tet启动子和氯霉素抗性（CAT）
pASK-IBA2C C-端 - - Yes No - CAT 2-1321-000
pASK-IBA3C C-端 - - No No - CAT 2-1322-000
pASK-IBA4C N-端 - - Yes No - CAT 2-1323-000
pASK-IBA5C N-端 - - No No - CAT 2-1324-000
pASK-IBA6C N-端 - - Yes Yes factor Xa CAT 2-1325-000
pASK-IBA7C N-端 - - No Yes factor Xa CAT 2-1326-000 

T7表达系统

特点和优点：
以pPR-IBA载体通过噬菌体T7启动子高水平表达
在BL21菌株中，在T7 RNA polymerase作用下高水平转录
无毒蛋白高水平表达
IPTG诱导
N-端或C-端导入Strep-tag II标签
适合体外转录和翻译
原理和特性：

　　Tet启动子具有中等强度，可以导致某些蛋白质的高水平表达（取决于如折叠速度和稳定性等难以预测的特性）。但是有些蛋白质只有经强启动子的转录才能高水平表达。在这些情况下我们推荐使用T7启动子。
　　T7表达系统在pPR-IBA载体上编码，该系统采用T7启动子和T7 RNA聚合酶以使目标基因高水平转录。目标基因的表达受到宿主细胞中T7 RNA 聚合酶的诱导。这一点可以通过使用大肠杆菌BL21来实现。E. coli BL21染色体上含有T7 RNA 聚合酶基因，该基因受lacUV5启动子控制；而该启动子受IPTG诱导。

查询多克隆位点请浏览http://www.iba-biotagnology.com/naps/naps_fr01_02.html
载体序列可从www.iba-bioTAGnology.com/download.html 下载

用于在大肠杆菌中表达的载体

Strep-tagÒ 载体概览：
　　IBA提供多种用于在大肠杆菌中表达的pASK-IBA载体以便携带有Strep-tag的重组蛋白表达。除了抗生素抗性基因（AmpR, CamR），pASK-IBA载体仅在XbaI和HindIII限制性酶切位点之间有区别。其区别如下图所示：您可以在N-或C-端标签之间、细胞质外周表达或细胞质表达之间和/或用以去除标签的内蛋白酶切割位点（Factor Xa, enterokinase, thrombin 和 TEV protease）之间作选择。请注意，通常无须去除标签。

双标签和6xHistidine-tag载体概览：
　　除了Strep-tagÒ 载体，IBA还提供带有Strep-tag和6xHistidine-tag的双标签载体以及6xHistidine-tag载体。一个蛋白质上的两个不同标签能产生最高的纯化因素，使得可以在变性或生理条件下纯化全长蛋白质。而且，直接从培养基开始的纯化操作可以被优化。
　　载体仅在XbaI和HindIII限制性酶切位点之间有区别。

哺乳动物表达载体

　　IBA的pEXPR-IBA载体是专为哺乳动物细胞中高水平表达和纯化重组Strep-tagÒ和/或 6xHistidine-tag融合蛋白而设计的。这些载体的克隆策略相同，因而与相应的细菌pASK-IBA质粒相兼容。因此，一个PCR片段可以被平行克隆进pASK-IBA及其相等的pEXPR-IBA。人巨细胞病毒(CMV)立早启动子在很多哺乳动物细胞中提供强表达。为了延长在转染细胞中表达的时间，载体会在潜伏感染了SV40大T-抗原（如COS7）的细胞系中复制。此外，新霉素抗性基因可以允许直接筛选稳定的细胞系。

pEXPR-IBA 特点 益处
Strep-tag II 采用Strep-Tactin基质纯化重组蛋白
CMV 立早启动子/增强子 在多种哺乳动物细胞中高水平表达
多克隆位点 插入目标基因并与Strep-tag和/或6xHistidine-tag融合。与pASK-IBA载体兼容
新霉素抗性基因 在哺乳动物细胞中筛选稳定的转染子
氨卞青霉素抗性基因 在E. coli中筛选
pUC复制起始位点 在E. coli中高拷贝复制
BM40 (仅见于pEXPR-IBA42 和44 ) 使蛋白质分泌进培养基中
Factor Xa, thrombin (thb), enterokinase (ent) ,TEV protease (TEV)切割位点 如果需要可以除去Strep-tag（一般不需要）


用于在酵母中表达的载体

　　IBA现供应两种带有Strep-tagÒ和瑞士Dualsystems Biotech AG（www.dualsystmes.com）的HA epitope-tag的酵母载体。

特点：
l 高水平、可诱导的表达
l 无需加入用于诱导的试剂或改变培养基
l 诱导受紧密调控使表达毒性蛋白质

载体pKS1-ST和pKS2-ST组合了蛋白质表达的两个重要特点：

l 可诱导的ADH2启动子：ADH2启动子受培养基中葡萄糖缺失的诱导。在早期生长过程中，葡萄糖充裕，启动子无活性，因此防止对酵母生长的负效应。当细胞到达静止早期时，葡萄糖被培养基耗尽，ADH2启动子被诱导，产生大量蛋白质。
l KanMX表达框：不象其他酵母表达载体，pKS-ST载体特有一个KanMX表达框，使得可以在丰富培养基中以G418筛选。丰富培养基如YPD的使用将显著增强细胞密度和蛋白质产量。

比较所有Strep-tagÒ, 6´Histidine-tag及double-tag载体

质粒 Strep-tag 6xHis
-tag HA
epitope-tag 分泌 Tag去除 蛋白酶 抗性 目录号
大肠杆菌载体:具有tet启动子用于胞质外周表达
pASK-IBA2 C-端 - - Yes No - Amp 2-1301-000
pASK-IBA4 N-端 - - Yes No - Amp 2-1303-000
pASK-IBA6 N-端 - - Yes Yes factor Xa Amp 2-1305-000
pASK-IBA12 N-端 - - Yes Yes thrombin Amp 2-1311-000
pASK-IBA14 N-端 - - Yes Yes enterokinase Amp 2-1313-000
pASK-IBA32 - C-端 - Yes No - Amp 2-1332-000
pASK-IBA44 N-端 C-端 - Yes No - Amp 2-1344-000
大肠杆菌载体:具有tet启动子用于细胞质表达
pASK-IBA3plus C-端 - - No No - Amp 2-1402-000
pASK-IBA5plus N-端 - - No No - Amp 2-1404-000
pASK-IBA7plus N-端 - - No Yes factor Xa Amp 2-1406-000
pASK-IBA13plus N-端 - - No Yes thrombin Amp 2-1412-000
pASK-IBA15plus N-端 - - No Yes enterokinase Amp 2-1414-000
pASK-IBA17plus N-端 - - No Yes TEV protease Amp 2-1416-000
pASK-IBA33plus - C-端 - No No - Amp 2-1433-000
pASK-IBA35plus - N-端 - No No - Amp 2-1435-000
pASK-IBA37plus - N-端 - No Yes factor Xa Amp 2-1437-000
pASK-IBA43plus C-端 N-端 - No No - Amp 2-1443-000
pASK-IBA45plus N-端 C-端 - No No - Amp 2-1445-000
pASK-IBA63a-plus C-端 - - No No - Amp 2-1463-100
pASK-IBA63b-plus C-端 - - No No - Amp 2-1463-200
pASK-IBA63c-plus C-端 - - No No - Amp 2-1463-300
pASK-IBA65b-plus N-端 - - No No - Amp 2-1465-200
大肠杆菌载体:具有tet启动子和氯霉素抗性（CAT）
pASK-IBA2C C-端 - - Yes No - CAT 2-1321-000
pASK-IBA3C C-端 - - No No - CAT 2-1322-000
pASK-IBA4C N-端 - - Yes No - CAT 2-1323-000
pASK-IBA5C N-端 - - No No - CAT 2-1324-000
pASK-IBA6C N-端 - - Yes Yes factor Xa CAT 2-1325-000
pASK-IBA7C N-端 - - No Yes factor Xa CAT 2-1326-000
大肠杆菌载体:具有T7启动子
pPR-IBA1 C-端 - - No No - Amp 2-1390-000
pPR-IBA2 N-端 - - No No - Amp 2-1391-000
哺乳动物载体：具有人CMV启动子
pEXPR-IBA3 C-端 - No No - Amp/Neo 2-1903-000
pEXPR-IBA5 N-端 - No No, - Amp/Neo 2-1905-000
pE, XPR,, , ,, -I, B, A7<, /DIV> N-端 - No Yes factor Xa Amp/Neo 2-1907-000
pEXPR-IBA13 N-端 - No Yes thrombin Amp/Neo 2-1913-000
pEXPR-IBA15 N-端 - No Yes enterokinase Amp/Neo 2-1915-000
pEXPR-IBA17 N-端 - No Yes TEV protease Amp/Neo 2-1917-000
pEXPR-IBA42 C-端 N-端 - Yes No - Amp/Neo 2-1942-000
pEXPR-IBA43 C-端 N-端 - No No - Amp/Neo 2-1943-000
pEXPR-IBA44 N-端 C-端 - Yes No - Amp/Neo 2-1944-000
pEXPR-IBA45 N-端 C-端 - No No - Amp/Neo 2-1945-000
酵母载体：具有ADH2启动子
pKS1-ST N-端 - N-端 No No - Amp/G418 2-3801-000
pKS2-ST N-端 - N-端 Yes No - Amp/G418 2-3802-000

每个载体的规格：5ｕg

产品 规格 目录号
测序引物
pASK-IBA载体：上游测序引物 1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-101
pASK-IBA载体：下游测序引物 1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-102
pASK-IBA载体：上、下游测序引物 1nmol each, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-104
pPR-IBA载体：上游测序引物 1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-111
pPR-IBA载体：下游测序引物 1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-112
pPR-IBA载体：上、下游测序引物 1nmol each, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-114
pEXPR-IBA载体：上游测序引物 1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-121
pEXPR-IBA载体：下游测序引物 1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-122
pEXPR-IBA载体：上、下游测序引物 1nmol each, 10pmol/ul, HPLC纯化 5-0000-124

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