Cre-loxP/基因重组/基因敲除_其它_技术服务_供应

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服务名称：	Cre-loxP/基因重组/基因敲除

Cre-loxP/基因重组/基因敲除

Cre-loxP是一种位点特异的基因重组技术，在真核生物和原核生物中均有广泛应用。2007年，美国犹他州大学的马里奥-R-卡佩奇（Mario R. Capecchiand）、北卡罗莱纳州大学的奥利弗-史密斯（Oliver Smithies）以及英国卡迪夫大学的马丁-J-埃文斯（Martin J. Evans）由于在Cre-loxP基因重组技术方面所作的贡献获得了诺贝尔生理医学奖。

Cre-loxP的基本原理

Cre蛋白是一种重组酶，是Cyclization Recombination Enzyme的缩写，于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号为X03453），编码38kDa蛋白质，Cre重组酶是由343个氨基酸组成的单体蛋白。

LoxP位点，是locus of X-overP1 的缩写，是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定loxP的方向，loxP位点的序列如下所示：

Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使两个loxP位点间发生基因重组。Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。

Cre-loxP诱导基因重组的几种方式

当细胞基因组内存在两个loxP位点时，一旦有Cre重组酶出现，就会诱导两个loxP位点间的序列发生重组。首先，Cre重组酶结合到两个13bp的回文序列形成二聚体，然后这个二聚体和另外一个loxP位点上的二聚体结合，形成四聚体。LoxP位点是有方向的，形成四聚体的两个loxP位点是平行的，随后这两个loxP位点间的双链DNA被Cre重组酶切掉，然后切口在DNA连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于两个loxP位点的方向，主要有以下几种可能：

1.如果两个loxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个loxP位点间的序列（图1A）；

2.如果两个loxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能诱导两个loxP位点间的序列翻转（图1B）；

3.如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能诱导两条DNA链的交换或染色体易位（图1C）。

图1. Cre-loxP诱导基因重组的方式，敲除（A）、翻转（B）、易位（C）

Cre-loxP系统的优点

在当今世界上，Cre-loxP系统是在神经系统中应用最广泛的条件性基因敲除工具，主要是因为该系统有如下优点：

1.高效性：Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片段形成复合物之后，可以提供足够的能力引发之后的DNA重组过程，重组过程简约高效；

2.特异性强：loxP位点是一段含回文序列结构和中间有间隔的34bp元件，这种结构保证了loxP序列的唯一性，从而保证基因重组的特异性；

3.可应用范围广：Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用，所以说Cre-loxP系统的可应用范围非常广；

4.可由二型启动子启动表达：Cre重组酶的编码基因可由任何一种二型启动子驱动，由此保证Cre重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的生理条件下表达，从而实现较高的组织和细胞特异性。

Cre-loxP系统的操作方式

一. 转基因动物依赖的基因重组

一般情况下，科学家们利用Cre-loxP系统进行基因操作时，会采用两种转基因动物进行杂交，即一种带Cre的转基因动物和一种带loxP序列的转基因动物进行交配，使得后代既带Cre又带loxP基因，然后Cre重组酶会识别loxP位点，导致基因重组（图2）。由于Cre基因的表达受上游启动子的调控，这样启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。虽然该方法可以实现高效、特异的基因重组，但是以下不足限制了用转基因动物进行基因操作的发展：

1.转基因动物的难以获得：目前虽然已经有一些Cre和loxP转基因动物，但是要获得这些转基因小鼠比较困难，特别是对于国内的科研工作者来说。而且还有很多Cre和loxP转基因动物没有被制作出来，或者没有公开发布保存，如果要自己制作转基因动物的话，非常耗时间而且成本也很高，因此说要获得需要的转基因动物比较困难；

图2.用Cre和loxP转基因老鼠进行基因敲除操作

二. 病毒依赖的基因重组

由于转基因动物依赖的基因重组存在以上不足，现在越来越多的科研工作者开始采用比较灵活的方式使用Cre-loxP系统。通过病毒引入Cre或loxP元件，结合一种转基因小鼠是最常用的方式（图3）。相比于转基因动物依赖的基因重组，病毒依赖的基因重组有以下优点：

1.更强的区域特异性：由于病毒可以通过局部注射的方式保证区域特异性感染，再加上驱动Cre基因的特异性启动子，能够实现更强的区域和组织特异性；

2.更少的花费：购买转基因动物的费用一般是比较昂贵的，而且转基因动物的饲养、基因型鉴定都需要消耗人力、物力，而病毒的制备、保存和注射所需的费用相对来说较少；

3.更短的实验周期：由于病毒能非常迅速地起作用，而转基因小鼠的繁育过程特别耗时间，因此采用注射病毒到转基因小鼠体内的方式，可以大大缩短实验周期。

图3.病毒依赖的基因敲除操作示意图，注射Cre病毒进loxP转基因小鼠体内（A），
或者注射loxP病毒到Cre转基因小鼠体内（B）

改造的Cre-loxP系统

经过现代基因工程方法对Cre和loxP元件的改造，Cre-loxP系统实现了更加丰富的条件性重组策略。

1.对Cre元件的改造：对Cre元件的改造提高了Cre重组酶的活性，并且实现了药物可诱导性。例如，通过在Cre元件上引入真核细胞核定位序列NLS，Cre重组酶能在低表达丰度下实现重组，这对于一些低丰度的启动子很重要。另外，在Cre元件的C端接上一段改造过的配体结合结构域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD将定位在胞浆内，当人工合成的激素分子结合到Cre-LBD受体后，蛋白构象改变并进入核内，介导基因重组，目前使用最多的是tamoxifen诱导的CreERT2突变体，它的LBD来自于雌激素受体ER分子，当有tamoxifen的时候，Cre重组酶才能诱导基因重组，这样通过控制tamoxifen的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控；

2.对loxP元件的改造：loxP元件也有一些突变体，间隔区和回文序列都可以进行突变，突变后的序列依然能被Cre重组酶识别和重组，但是突变的loxP序列必须和同样突变的loxP序列匹配介导基因重组，而不能和未突变的loxP序列匹配，这样将不同的loxP序列组合用于控制多个基因，在同一Cre重组酶的作用下，可以实现多序列的基因重组，产生非常多元的重组结果。例如彩虹脑（Brainbow）技术绚丽多彩的荧光标记效果正式基于对loxP序列的改造实现。

Cre依赖的基因表达

Cre-loxP系统介导条件性基因表达有以下几种方法：

策略一：是将转录终止信号盒（transcription STOP cassette）置于启动子与目的基因之间，转录终止信号盒两端各有一个loxP位点，且为同向。在无Cre蛋白存在时，转录终止信号盒下游靶基因完全不表达,但当含有转录终止信号盒结构的转基因小鼠与Cre重组酶转基因小鼠杂交，后代双转基因小鼠表达Cre蛋白，将介导基因重组移除转录终止信号盒，进而诱导loxP位点后的目的基因表达（图4A）。此法的缺点是会发生transcriptional leak；

策略二：是构建两个反向的loxP位点（single-floxed inverse open reading frames），在Cre重组酶的作用下，loxP位点之间的靶基因可逆性地反向倒转，然后靶基因表达（图4B）。此法的缺点是基因可能会由于连续翻转而影响蛋白表达；
策略三：是分别构建两对不相容的反向lox位点，如loxP和lox2722（double-floxed inverse open reading frames），首先任一对lox位点间的序列发生可逆的快速翻转，然后Cre重组酶不可逆切割防止基因的再次翻转（图4C、图5）。

图4. Cre依赖的条件性基因表达示意图
（Nature Reviews Clinical Oncology. August, 2010）

图5. Cre介导纹状体伏核区中等多棘神经元表达Egr3
（The Journal of Neuroscience. May, 2015）

Cre依赖的基因敲除

基因敲除是指通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在神经系统研究领域，Cre-loxP系统与立体定位注射技术和基因打靶技术的结合，可允许靶基因的缺失仅发生在小鼠发育的某一阶段或特定的组织器官；若与控制Cre表达或功能的诱导调控系统以及转基因技术联合应用,则使靶基因的缺失仅出现在动物生命期的特定时间和特定的细胞类型，从而实现条件性基因敲除和诱导性基因敲除。

1.条件性基因敲除：在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox（flanked by loxp）小鼠，将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

2.诱导性基因敲除：也是以Cre-loxP系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术（图6）。