细胞增殖及毒性检测-Cell Counting Kit （CCK试剂盒)

CellCounting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST（水溶性四唑盐，化学名：2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

CCK是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点：

-CCK被线粒体内的脱氢酶还原成的formazan是水溶性，不需要有特定的溶解液来溶解，而WST和XTT、MTS产生的formazan都不是水溶性的，因而可以省去后续溶解步骤。

-CCK比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。

-CCK和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。

CCK毒性：CCK和其他检测方法相比，对细胞几乎无毒性，不伤害细胞，细胞可重复利用。

CCK应用：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏实验。

CCK法与其他检测方法之间的比较

操作说明：

一、制作标准曲线(测定细胞具体数量时)

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例(例如：1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间)。

二、细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液(100ul/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(在37℃，5% CO2的条件下)。

2、向每孔加入110ul的CCK 溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10ul 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增值-毒性检测

1、在96 孔板中配置100ul的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5% CO2的条件下)。

2、向培养板加入10ul不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如：6、12、24或48小时)。

4、想每孔加入10ul  CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

7、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10ul 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

备注：

① 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK试剂后的培养时间。

② 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔减的差异。加入

CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。

③ 白细胞可能需要培养较长时间。

④ 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100ul培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100ul培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。

⑤ 如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。

⑥ 培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

活力计算：

　　细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

保存条件：

4℃避光保存，有效期一年。