单链构象多态性检测

技术路线：

1、基因组抽提与质检；

2、PCR扩增靶DNA；

3、将特异的PCR扩增产物变性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子 ；

4、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；

5、银染显色；

6、结果分析与报告。

样品要求：

1、组织样本：-20℃或-80℃低温冰箱中保存，液氮或者干冰运输。若提供的材料为新鲜组织、血液细胞等生物材料，请提供足够提取2ug以上基因DNA的材料量；

2、DNA样本：体积≥20ul，浓度≥100ng/ul，DNA总量≥2ug，20℃保存，低温冰袋运输；

3、血液样本：要求保存于抗凝管中或冻存管中，体积大于2ml，请用干冰运送，保证DNA不降解；

4、样品为石蜡包埋组织切片的，要求提供10张组织切片光片（面积>10mm×10mm,厚度约5-10um）；

服务说明：

1、核酸片段的大小:用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于<200 bp的片段，SSCP可发现其中70％的变异；对于300 bp左右的片段则只能发现其中50％的变异；而＞500 bp的片段，则仅能检出10％~30％的变异，因此，<300bp，尤其是150 bp左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400 bp的DNA片段，再进行SSCP分析；

2、游离引物: 游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6 nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰；

3、假阴性: 一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果则难以完全消除。

提交的产品和资料：

1、合成的引物；

2、电泳图谱；

3、实验报告。