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胰酶细胞消化液(不含EDTA)
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瑞典BioLamina人类重
BioLamina人类重组层| 货号： | 05-200-1A/B，05-201-1U/06，05-752，03-079，03-048等 |
| 保存条件： | ﹣20℃ |
| 供应商： | 上海逍鹏生物科技有限公司 |
| 数量： | 100 |
| 保质期： | 1年 |
| 规格： | 100ml&500ml |
人类间充质干细胞无血清培养基，无血清，无异源动物成分，在国外已经用于临床。适合脐带（消化法和组织块法），骨髓和脂肪多种来源MSC增殖，且有对应成脂，成骨和成软骨诱导分化试剂，配套三种染色试剂，MSC专用重组胰酶和抑制剂，MSC专用无血清冻存液，一气呵成。
以色列MSC无血清培养基在美国已按原料药要求递交DMF文件，且已通过FDA药物评价及研究中心（Center for Drug Evaluation and Research, CDER）的审核，获得DMF颁发的登记号，No：29469。
可与我们索取参考文献和实验结果，谢谢！
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NutriStem® MSC XF Medium是无血清、无异源动物组分，促进多种来源的人类间充质细胞生长的培养基，如骨髓（BM-hMSC）、脂肪组织（AT-hMSC）、脐带（UCM-hMSC）。NutriStem® MSC无血清培养基促进人类间充质干细胞的长期生长，同时还能保持自我更新及多向分化潜能。
表1 MSC NutriStem® XF Medium
| 品牌 | 货号 | 名称 | 规格 | 保存条件 |
| Biological Industries | 05-200-1A | MSC NutriStem® XF Basal Medium MSC无血清基础培养基 | 500ml | 4℃ |
| Biological Industries | 05-201-1U | MSC NutriStem®XF Supplement MSC无血清添加剂 | 3ml | -20℃ |
| Biological Industries | 05-752-1F | MSC Attachment solution (100X) MSC贴壁试剂 | 1 ml | 4℃ |
表2 建议选用试剂
| Biological Industries | 03-079-1B | Recombinant Trypsin-EDTA Solution重组胰酶-EDTA | 100ml | -20℃ |
| Biological Industries | 03-048-1C | Soybean Trypsin Inhibitor (50X) 大豆胰酶抑制剂 | 20 ml | -20℃ |
| Biological Industries | 05-712-1D | MSC Freezing Solution MSC 冻存液 | 10 ml | 4℃ |
| Biological Industries | 02-023-1A | DPBS (w/o Ca & Mg) DPBS缓冲液 | 500 ml | RT |
| Biological Industries | 03-031-1B | Penicillin-Streptomycin Solution(100X)青链双抗 | 100ml | -20℃ |
一、实验前准备：
1.1 完全培养基的准备
1.1.1 冻存的MSC NutriStem® XF Supplement在室温或2-8℃解冻，避免反复冻融。
1.1.2 配制：MSC NutriStem® XF Basal Medium（培养基）：MSC NutriStem® XF Supplement（添加物）：青链双抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2周内使用。
注1：双抗非必须，建议原代（P0）时使用。
注2：培养基含L-Glutamine，贮藏时避免长期照光。
1.2 包被培养皿
1.2.1 使用DPBS溶液（货号：02-023-1A），将MSC贴壁试剂稀释100倍（1:100）。
1.2.2 参照表3，加入适量的1XMSC贴壁试剂涂层培养皿或板。
表3 涂层过程中贴壁试剂建议使用量
| 培养器皿 | 表面积cm2/孔或瓶 | 1X MSC贴壁试剂使用体积 |
| 96孔板 | 0.34 | 0.05~0.1 ml |
| 24孔板 | 1.9 | 0.2~0.4 ml |
| 12孔板 | 3.9 | 0.4~0.8 ml |
| 6孔板/ 35 cm培养皿 | 9.6 | 1~2 ml |
| T25瓶/ 60 cm培养皿 | 25 | 2.5~5 ml |
| T75瓶 | 75 | 7.5~15 ml |
注2：包被期间， 注意包被液不可以干掉！
注3：若使用预包被培养瓶（Corning的CellBind，货号：3289/3290等）, 步骤5.2的包被可略过。
1.2.3 轻轻摇动培养皿，确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后，用封口膜包裹涂层的培养皿。
1.2.4 在2-8℃孵育过夜；或者在CO2培养箱，37℃,至少孵育30分钟。
1.2.5 接种前, 吸除贴壁试剂，再用DPBS轻轻冲洗培养皿，即可接种细胞。
1.3 制备1X大豆胰酶抑制剂
1.3.1 使用无菌的DPBS，将50X大豆胰酶抑制剂（03-048-1C）稀释成1X。
二、使用范例：
2.1 UC-MSC原代培养 （组织块法）
2.1.1 无菌条件下取新鲜脐带，用DPBS漂洗净血迹
* 一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用75%酒精润洗。
2.1.2 置10cm 培养皿中，剪成1~2cm脐段，剔除血管，用DPBS洗净血迹，再剪成1mm3组织块。(图 1)
2.1.3 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。
2.1.4 37℃，5%CO2培养箱孵育 30min，以使组织块粘贴在培养皿壁上。
2.1.5 向每孔滴加0.8ml 完全培养基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块)。
21.6 37℃，5% CO2 培养箱孵育过夜，次日 (D1) 每孔再补加1ml 完全培养基。
2.1.7 37℃，5% CO2 继续培养，5天 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞，但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出)。
2.1.8 再过5天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出，但最晚可到14天会出现细胞从组织边沿爬出) (图2、图3)。
2.1.9 每2天换一次培养液，继续培养2~4天，待细胞融合度（Confluency）达到约80%后传代培养(图4)。
注1：组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。
注2：为增加成功率，从原代分离脐带和脂肪间充质干细胞, 培养基可加2.5%的人 AB 血清(人AB 型血清必须除菌过滤，且 HbsAG 及HCV/HIV 抗体阴性)。
2.2 UC-MSC原代培养 （消化法）
MSC NutriStem® XF Medium也能有效地培养消化法取得的原代细胞，操做方式可依各实验室的实验步骤，或参考上海逍鹏MSC AF Tissue Digestive Mix (货号：C35010010) 的使用说明。
2.2.1 将脐带用DPBS漂洗干净，剪成1-2cm,后剔除血管。
* 一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用75%酒精润洗。
2.2.2 将组织剪成3-5mm3后，移入50ml离心管，再加入的分离液。
* 一条10-15公分的脐带建议加入10ml的分离液；或者确保液面稍高于组织块即可。
** 视情况而定，可自行在分离中添加抗生素。
2.2.3 把50ml离心管横放在细胞培养箱，反应过夜。
2.2.4 加入10ml的0.05% EDTA（BI/03-015-1B）混合终止反应后，3000 rpm离心5分钟，去除上清。
* 溶液比较浓稠，小心不要影响下层的细胞；建议吸弃15ml左右的上清。
2.2.5 以10ml的无钙镁DPBS（BI/02-023-1A）重悬细胞后，2000 rpm离心5分钟，去除上清。
2.2.6 再次以10ml的无钙镁DPBS（BI/02-023-1A）重悬细胞后，1000 rpm离心5分钟，去除上清。
2.2.7 用适量的培养基重悬细胞后，即可按常规细胞培养方法接种P0细胞培养。
2.3 UC-MSC传代培养与冻存
2.3.1 待细胞融和度达到约80%后进行传代（细胞不能太密集，否则容易分化），吸弃传代板孔中的培养基，每孔加适量DPBS轻轻冲洗1次。
2.3.2 根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA（货号：03-079-1B，T25建议使用1ml），在37℃，5% CO2培养箱作用3~5 min（可轻拍培养瓶帮助细胞脱落）
2.3.3 显微镜下观察细胞完全脱落后, 根据重组胰酶-EDTA使用量加入10倍体积的大豆胰酶抑制剂（1X），1000rpm离心3~5min。例：用1ml重组胰酶-EDTA，则加入10ml大豆胰酶抑制剂（1X）与细胞混和均匀，再离心。
2.3.4 谨慎吸出上清，细胞团块用适当体积的完全培养基悬浮后，混匀细胞悬液。
2.3.5 按照所需的比例进行传代或按照5000-6000cells/cm2的细胞密度将细胞接种至培养器皿中，放入37℃, 5% CO2培养箱内培养。
2.3.6 每2-3天更换一次培养基，待细胞融合度达到80%左右时，参照操作步骤6.3.1~6.3.5做细胞传代;或者参照操作步骤6.3.1~6.3.3收获细胞冻存。
2.3.7 细胞冻存：将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 冻存液（货号：05-712-1D）中，装入冻存管，2~8℃冰箱放置30min，-80℃冰箱放置 24h，转入液氮罐冻存。
注：本方法仅供参考，用户可根据自身经验做合理调整。
温馨提示：不可用于临床治疗。
