荧光素酶活性检测服务

荧光素酶活性检测服务
 
启动子活性检测

 启动子的序列通常是转录起始位点或者第一个外显子的上游。如果我们知道了某一基因的转录起始位点，我们可以非常确信的知道该基因的启动子位置。对于很多物种像人，小鼠，基因组已被人们研究的极为透彻。目前常用的基因组数据库有NCBI，Ensembl and UCSC。BioLadder生物科技有限公司通常通过Ensembl基因组数据库来寻找某一基因的启动子序列.该实验的具体流程为：
1）确定某一基因的启动子序列；
2）以基因组DNA为模板，设计引物PCR扩增出该目的基因片段
3）将目的基因重组到pGL3-basic vector上，经测序验证正确后，方可进行下一步实验；
4)将构建好的含靶基因启动子的荧光素酶载体，转染到293T细胞中，检测荧光素酶的活性。

microRNA靶基因结合位点

 据估计，30％的人类基因的由miRNA的调控。microRNA靶基因的预测及鉴定是microRNA研究的重要组成部分。荧光素酶报告实验可以有效地验证microRNA是否直接地调控靶基因的表达。科学家们将靶基因的UTR全长或者UTR的部分片段以及结合位点区克隆出来，重组到荧光素酶报告基因的载体上，利用荧光素酶的活性高低，比较分析microRNA是否与靶基因的直接调控。该项技术为科研工作者研究microRNA与靶基因的互作提供有利的工具。
服务信息：
1.生物信息学预测（pictar、target scan 、RNAhybrid等）预测结合位点：
生物信息学预测microRNA靶基因结合位点采用pictar、Targetscan等软件联合预测microRNA及靶基因结合位点,同时分析靶位点的保守性。具有准确、真实、严谨的优点。
2.基因3’-UTR荧光素酶载体构建：
针对3'-UTR全长序列，设计引物以基因组DNA或者cDNA做为模板，PCR扩增，再将PCR产物重组到psiCHECK-2（promega公司），经测序验证正确后，放可进行后续实验针对靶基因结合位点，设计引物，采用stratagen公司的quickchange 试剂盒对靶基因结合位点进行定点突变。
3.基因结合位点荧光素酶载体构建：
软件预测靶基因结合位点,针对结合位点，化学合成DNA单链，同时突变结合退火、连接重组到psichek-2载体。
4.细胞转染及荧光素酶活性检测。
将microRNA以及荧光素酶报告共转染到靶细胞中，Tecan 1000或检测荧光素酶及萤火虫酶的活性，分析数值。
A:生物信息学预测调控靶基因的microRNA   B：mir-101调控E2H2的UTR靶基因示意图
服务说明：
1.遵循实事求是的原则，恕不确保客户预期想要得到的结果。
2.向客户提供荧光素酶载体的测序报告及原始文件及菌液、质粒。
3.最终提供完整的实验报告，包括材料与方法、实验结果等。
服务特点：
1.速度：三周内完成载体构建。
2.准确：采用双荧光素酶，萤火虫荧光素酶及海蜃荧光素酶，准确性高。
3.可重复：检测仪器为tecan1000，设置三重复，保证实验可靠。
4.经济：价格低，载体构建（野生型及突变型）+ 荧光素酶检测只需5000元。
5.有效：预测准确。
案例：
psicheck-2的载体酶切图谱：

载体测序结果图：

UTR全长
ATPase：
 
双荧光素酶报告基因:

柱状图:

参考文献：
1.Drosophila Argonaute1 and Argonaute2 Employ Distinct Mechanisms for Translational Repression. Iwasaki S, Kawamata T, Tomari Y Mol Cell. 2009 Apr 10;34(1):58-67.
2.Kevin C. Miranda, Tien Huynh, Yvonne Tay, Yen-Sin Ang, Wai-Leong Tam, Andrew M. Thomson, Bing Lim and Isidore Rigoutsos: A Pattern-Based Method for the Identification of MicroRNA Binding Sites and Their Corresponding Heteroduplexes. Cell, Volume 126, Issue 6, 1203-1217, 22 September 2006.
3.Lee P. Lim, Nelson C. Lau, Philip Garrett-Engele, Andrew Grimson, Janell M. Schelter, John Castle, David P. Bartel, Peter S. Linsley & Jason M. Johnson: Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 433, 769-773 (17 February 2005).
4.Soraya Yekta, I-hung Shih and David P. Bartel: MicroRNA-Directed Cleavage of HOXB8 mRNA. Science 23 April 2004: vol. 304 no. 5670 pp. 594-596.
 

报告基因检测

 
创翼公司针对客户提供的任一荧光素酶载体，提供检测荧光素酶活性的技术服务。
本实验的流程为：
1）细胞培养，根据客户的需求培养HEK293细胞及其它易于转染的细胞；
2）细胞转染，针对specific细胞，采用脂质体转染，电转等方法针对特异性的细胞，将目的载体转染到细胞中，实验通常设置4~5重复；
3）转染后的某一时间点，检测荧光素酶的活性，既可以检测luciferase的活性，同时检测fiefly的活性。