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组蛋白甲基化/磷酸化/乙酰化检测实验
蛋白质组学实验 ITRAQ实验
重组蛋白表达与纯化服务
通过天津市河东区市场和质量监督管理局认证 
酵母双杂交文库构建/| 提供商： | 天津博耘众欣生物技术服务 |
| 服务名称： | 专业提供GST-pull down检测 |
实验流程：
一、原核融合蛋白A（GST-A融合蛋白）的获得
1．构建PGEX-5X-1/A原核表达载体，将重组质粒转化BL21(DE3)菌株
2．挑取单个克隆到含有5ml LB(+100ug/ml Amp)的10ml试管里，37℃培养过夜，小量诱导表达以确定最佳诱导条件
3．将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/ml Amp)的1L锥形瓶中过夜培养，以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白
4．室温冻融菌体，加入细菌裂解液吹打混匀，冰上超声破碎至裂解液充分清亮
6．离心分离上清，-80℃保存备用
二、真核融合蛋白B（cMyc-B融合蛋白）的获得
将编码B蛋白的cDNA序列克隆到pCDNA3-cMyc真核表达载体上，进行细胞转染。
三、谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理
四、谷胱甘肽-琼脂糖树脂结合GST融合蛋白
五、预清除细胞裂解液
1．裂解真核融合蛋白B ：吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎，离心取上清
2．将细胞裂解液与50ul的和GST融合蛋白结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育
3．离心后将上清转移到新的离心管中
六、探测细胞裂解液
1． 设定两个等量预清除的细胞裂解液分别加入到结合GST和GST-X蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中，4℃翻转混合孵育过夜
2． 离心后用1ml冰冷的细胞裂解液洗涤，重复洗三次
3． 加入50ul的2*Loading Buffer。轻弹混匀，沸水煮5~10min，离心后收集上清
4． SDS-PAGE分离相互作用蛋白，Western-Blot检测目的蛋白
