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质粒中提过滤法I型试剂盒

产品价格: ¥553.00

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发货时限:
暂无
所在地区:
中国上海
有效期至:
长期有效
最后更新:
2021-05-22 01:30:02
浏览次数:
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产品详情

品牌名称:
biomiga

发布:www.yuekebio.com   时间:2009-6-19    上海悦克生物科技有限公司  

  
产品编号:
6172153316
产品名称:
质粒中提过滤法I型试剂
规  格:
产品备注:
质粒中提过滤法I型试剂盒简明步骤(PD1413)
产品类别:
BIOMIGA

 
    质粒中提过滤法I型试剂的详细说明:

质粒中提过滤法I型试剂盒简明步骤(PD1413
(详细内容请参考英文说明书)
I.                  实验前准备
II.               注意事项
RNase A: 使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。
质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时,使用2倍的菌液体积,2倍的Buffer A1,B1,C1,100%乙醇,相同体积的Wash Buffer (70% 乙醇)和Elution Buffer.
转化菌: 若为-70oC甘油冻存的菌,请先涂布平板培养后,再重新挑选新的单个菌落进行培养。
切勿直接取冻存在4oC的菌进行培养。
柱结合能力:250 μg
对富含内源核酸酶的宿主菌(endA)如HB101, JM101, TG1等,需去核酸酶,请使用产品PD1712。
Buffer B1: 在低于室温时会沉淀,请于50oC左右水浴加热至沉淀完全溶解,溶液澄清,使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。
Buffer C1: 在低于10oC会沉淀,请于37oC左右水浴加热至沉淀完全溶解。
准备70%和100%的乙醇。
在室温下(22-25oC)进行所有离心操作。
III.           操作步骤
离心法:
1.      取50 µL新鲜的菌液接种到15-50 mL (勿超过 50 mL)的LB培养基(含适量抗生素),37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清。
注:残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分,离心后沉淀较松,不能有效吸取上清。
注:本说明书中的操作程序适用于标准LB (Luria Bertani)培养基培养12-16 小时后,OD600(细菌密度)在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基,例如TB 或2×YT,请注意保证OD600不超过3.0。
2.      加入2.5 mL Buffer A1确保已加入RNase A),用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
注:不完全悬浮易导致菌体裂解不完全,从而使产量降低。
3.      加入 2.5 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀,然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 
注:切勿剧烈振荡。静置时间不应超过5分钟,时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到破坏。若溶液未清亮澄清,则表明菌体裂解不充分,应加大Buffer B1的用量或减少菌体量。
4.      加入3.0 mL Buffer C1, 立即反转5次,用手用力摇晃3-5次充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。
5.      将裂解液转移至过滤器中,放在一个15mL的试管上静至10分钟。管中的白色絮状沉淀浮上来,对准15mL的管向下压,使裂解液尽可能多的通过,有些裂解液可能会残留在沉淀中。
注:静至10min时RNase将工作,排除RNA污染。
6.      3.0 mL 100% 乙醇加至15 mL管中,立即混匀,混合液需马上过DNA柱。
7.      立即转移6.0 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中,室温下5,000 g离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。
注:如果50 mL的收集管与离心机转子不符,可在台式离心机 3,000 rpm 离心1分钟。
8.      向离心柱中加入4.0 mL 70% 乙醇,室温下5,000 g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。可选步骤:重复步骤“8”。
9.      将离心柱放回高速离心机中,室温下5,000 g开盖离心10分钟,以彻底去除残留的乙醇。
注:此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇,乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率。
10.  将离心柱转至一个新的15 mL离心管中,向DNA柱膜的正中加入0.5 mLddH2OpH7.0-8.5之间)Elution Buffer,室温放置1分钟,5,000 g 离心5分钟,以洗脱质粒DNA。
注:提取到的质粒DNA可直接用于基因克隆、测序、酶切、文库筛选、体外转录翻译、转染HEK293细胞。若用于转染内毒素敏感性细胞株,原代细胞及用于微注射,建议去除内毒素(PD1416)。
11.  可选步骤:若想提高得率,可用0.5 mL的ddH2OpH7.0-8.5之间)Elution Buffer再洗脱一次,收集到新的离心管中。
真空法:
1.      按离心法的步骤1-6进行操作。
2.      先将离心柱与真空负压装置连接,再将裂解液/乙醇的混合液转移至DNA柱,施加压力使溶液过DNA柱,重复操作至全部溶液通过柱子。
3.      4.0 mL 70%乙醇洗两次柱子,倒掉负压装置中的废液,将DNA柱重新与真空负压装置连接。
4.      施加压力15分钟以抽干柱子去除残留的乙醇。
注:有残留的乙醇会使柱上的DNA无法洗脱,同时处理10个样品时增加负压时间至20分钟。
5.      拆掉与负压装置的连接,将柱子的尖端和柱内壁用纸巾擦干。
6.      按照离心法的10-11步洗脱质粒DNA。
IV.            DNA浓度及纯度
DNA浓度(µg/mL) = OD260 x 50 x 稀释倍数.
OD260/ OD280约为1.7-1.9
V.               常见问题及解答
1、没有提出质粒或者质粒收获量很低
A、菌种老化:
ü               建议:对于甘油保存的菌种,需要先进行活化。涂布或者划线菌种,重新挑选单菌落进行液体培养,并对菌种进行初摇活化,按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养细胞最好不要超过16小时。
B、低拷贝质粒:
ü               建议:如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低,可以采用两倍的菌体量,并相应增加各种Buffer的用量,如果必要,更换具有相同功能的高拷贝质粒载体。
C、质粒丢失
ü               建议:某些质粒在多次继代培养的过程中会出现丢失的现象,另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
D、裂解不充分
ü               建议:如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备,会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。请根据选取的试剂盒,处理相应量的细菌量。
EBuffer中有沉淀未溶解
ü               建议:Buffer B1和Buffer C1在温度较低时会出现沉淀,使用前请检查是否有沉淀生成,如有沉淀生成,请置于50oC温育片刻,待溶液澄清后使用。
F、乙醇比例不对
ü               建议:按照说明书要求使用70%的乙醇洗脱,使用后旋紧瓶盖,防止乙醇挥发。
G、离心柱中乙醇残留
ü               建议:漂洗后,可适当延长离心时间,已尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提,大提和超大量提取,建议离心后,将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻,以彻底去除残留的乙醇,便于洗脱和后续实验操作。
E、洗脱液加入位置不正确
ü               建议:洗脱液应加在膜中央,已取得最好的洗脱效果。
F、洗脱液pH值不正确
ü               建议:将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0~8.5之间,如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果,请使用试剂盒配套的Elution Buffer(pH 8.5,10mMTris-HCl)进行洗脱,如果用ddH2O进行洗脱,请确保pH在7.0~8.5之间。
G、洗脱体积及时间的选择
ü               建议:洗脱体积将会影响最终的收获量,洗脱体积越大,收获量越高,但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱,以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒,请减少洗脱体积。另外,如果想收获高浓度高收获量的质粒,可进行二次洗脱。
ü               建议:加入洗脱Buffer后,室温放置2~5分钟,更有利于洗脱。
2、质粒纯度不高
A、蛋白质污染OD260/ OD280<1.7
ü               建议:选择推荐量的菌体,离心后小心吸取上清,如果上清液中混有悬浮物,可再次离心,以彻底去除蛋白质。
BRNA污染OD260/ OD280>1.9
ü               建议:检查配送的RNase A是否完全加入到Buffer A1中,加入RNase A后,Buffer A1/RNase A应该存放在4oC,如果存放时间过长,或者没有正确存放,请重新加入RNase A。加入Buffer C1后应在室温下离心,RNase发挥作用。
C、基因组DNA污染
ü               建议:加入Buffer B1后,轻轻颠倒混匀,避免剧烈震荡涡旋,加入Buffer B1的处理时间最好不要超过5分钟。
3、加样时DNA飘出加样孔外
建议:柱中残留乙醇未除净, 洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在硅胶膜上。可再离心或者抽真空

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