Hieff NGS™ MaxUp DNA Library Prep Kit for Illumina®

产品信息

产品描述

Hieff NGS^TM MaxUp DNA Library Prep Kit for Illumina^®是针对Illumina^®高通量测序平台专业开发设计的建库试剂盒。本试剂盒可将低至1 ng的微量片段化DNA制备成适用于Illumina^®测序平台的专用文库。与常规分步法建库相比，Hieff NGS^TM MaxUp DNA Library Prep Kit for Illumina^®整合了多个酶反应步骤，提供简并的、线性化的操作方案，显著提高DNA建库效率。Hieff NGS^TM MaxUp DNA Library Prep Kit for Illumina^®使用精心优化的配方体系，适用于各类DNA样本的建库。本试剂盒中提供的所有试剂组分，都经过严格的质量与功能验证，最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

产品组分

运输与保存方法

冰袋运输。所有组分-20°C保存，有效期1年。

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打或轻轻振荡混匀，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次**钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

二、关于DNA片段化

1. 本试剂盒中兼容机械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本试剂盒兼容范围为1 ng-1 μg Input DNA。应尽可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高质量Input DNA。表1中列举了将本试剂盒应用于常见应用中推荐的Input DNA量。

表1 常见应用中推荐Input DNA量

【注】：上表为使用高质量DNA时推荐的Input DNA量，当Input DNA质量较差或需要进行片段分选时，应适当上调使用量。

3. Input DNA特指投入末端修复/dA尾添加步骤中的DNA。

4. Input DNA制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响末端修复/dA尾添加步骤反应效率，建议DNA片段化后进行磁珠纯化或分选。当使用机械法进行DNA片段化且产物不进行纯化或长度分选而直接建库时，请将DNA稀释在TE Buffer中进行片段化，请勿在灭菌超纯水中进行。当使用酶切法进行片段化且产物不进行纯化或长度分选而直接建库时，请确认Stop Buffer中不包含过量的金属离子螯合剂。如条件不满足，可先将片段化产物纯化或长度分选后溶于0.1×TE Buffer或灭菌超纯水中（≤50 μL），再进行文库构建。

三、关于接头连接（Adapter Ligation）

1. Yeasen提供以下Indexed Adapters，适用于Illumina^®高通量测序平台文库构建：

Cat#12611，Hieff NGS^TM Single-Indexed Adapter Kit for Illumina^®, Set 1；

Cat#12612，Hieff NGS^TM Single-Indexed Adapter Kit for Illumina^®, Set 2；

Cat#12614，Hieff NGS^TM Dual-Indexed Adapter Kit for Illumina^®；

2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。应选用优质的、正规厂家来源的Adapter。推荐Adapter与Input DNA摩尔比在10:1-200:1之间。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表2列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表2 1 ng-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

【注】：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]。

四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。

2. 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分选；如Input DNA质量<50 ng，建议您在文库扩增后进行分选。

3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮磁珠分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤！如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。

4. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

6. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

8. 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100 μL，不足时请用超纯水补齐。样品体积太小，将导致移液误差增大，进而影响分选的准确性。

9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

10. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存1周，-20°C可保存1个月。

五、关于文库扩增（Library Amplification）

1. 是否需要进行文库扩增取决于Input DNA量、Adapter是否为完整长度、应用需要等因素。如果使用非完整长度Adapter，必须进行这一步骤。

2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表3列举了使用本试剂盒，Input DNA量为1 ng-1 μg时，获得100 ng或1000 ng文库的推荐循环数。

表3 1 ng-1 μg Input DNA获得100 ng或1000 ng产物扩增循环数推荐表

【注】：此表只针对于无需双轮分选的建库步骤，如进行双轮分选，请适当延长3-4个循环。

六、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®、PicoGreen^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^TM DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. DNA质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. DNA Adapter：Cat#12611，Hieff NGS^TM Single-Indexed Adapter Kit for Illumina^®, Set 1或Cat#12612，Hieff NGS^TM Single-Indexed Adapter Kit for Illumina^®, Set 2或Cat#12614，Hieff NGS^TM Dual-Indexed Adapter Kit for Illumina^®或其他等效产品。

4. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

图1 MaxUp DNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 末端修复/dA尾添加（End Preparation/dA-Taling）

该步骤将Input DNA末端补平，并进行5’端***酸化和3’端加dA尾。

1. 将表4中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表4所示反应体系。

表4 末端修复/dA尾添加PCR反应体系

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表5所示反应程序，进行末端修复/dA尾添加反应。

表5末端修复/dA尾添加PCR反应程序

3.2 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤将3.1步骤的产物末端，连接特定的Illumina^®接头。

1. 根据Input DNA量按表2稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表6中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于3.1步骤PCR管中配制表6所示反应体系。

表6 Adapter Ligation PCR体系

【注】：*本公司接头浓度与常规商业化试剂盒一致，皆为15 μM。请根据注意事项三中的提示，对接头进行稀释，加水补齐，使接头体积为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表7所示反应程序，进行接头连接反应：

表7 Adapter Ligation PCR反应程序

【注】：当Input DNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。

3.3 连接产物磁珠纯化（Post Ligation Clean Up）

该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物，分选可筛选特定长度的DNA片段以符合测序需要。

3.3.1 纯化操作步骤：

1. 准备工作：将Hieff NGS^TM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取等体积Hieff NGS^TM DNA Selection Beads（1.0×，Beads:DNA=1:1）至Adapter Ligation产物中，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：

1）如产物无需进行片段分选，直接加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。【注：如纯化产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。

2）如产物需进行双轮分选，加入102 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。【注：如纯化产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。

3.3.2 双轮分选操作步骤：

1. 准备工作：将Hieff NGS^TM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

3. 根据DNA片段长度要求，参考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。

表8磁珠文库分选推荐比例

【注】：表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250 bp，样品DNA体积为100 mL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.70×100 mL=70 mL；第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 mL=20 mL；表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用户在接头连接前进行分选，请采用Hieff NGS^TM DNA Selection Beads（Cat#12601）说明书中推荐的比例。

4. 室温孵育5 min。

5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中。

6. 参考表8向上清中加入第二轮分选磁珠。

7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重复步骤9，总计漂洗两次。

11. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。

12. 将PCR管从磁力架中取出，加入适量21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中。

3.4 文库扩增（Library Amplification）

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表9中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表9所示反应体系。

表9 PCR扩增反应体系

【注】：表中Hieff NGS^TM Index Primer和Hieff NGS^TM Universal PCR Primer来源于Hieff NGS^TM Single-Indexed Adapter Kit for Illumina^®（Cat#12611ES，12612ES）；i5 PCR Primer和i7 PCR Primer来源于Hieff NGS^TM Dual-Indexed Adapter Kit for Illumina^®（Cat#12614ES）。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表10所示反应程序，进行PCR扩增。

表10 PCR扩增反应程序

3.5 扩增产物磁珠纯化或分选（Post Amplification Clean Up/Size Selection）

同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS^TM DNA Selection Beads（1.0×，Beads:DNA=1:1）纯化文库扩增产物。【注：若检测发现有较多的接头和引物二聚体残留，可重复一次纯化步骤。】

如需分选，操作方法同3.3.2双轮分选步骤（纯化步骤可省略）。

3.6 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。

3.7 参考实例

使用Hieff NGS^TM MaxUp DNA Library Prep Kit for Illumina^®对100 ng E.coli gDNA建库，接头连接后进行双轮分选（0.6×/0.2×和0.55×/0.15×），结果使用Agilent 2100 High Sensitivity Chip进行检测。

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